《Cell Reports Methods》：Development and application of nbLIBRA-seq for high-throughput discovery of antigen-specific nanobodies
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纳米抗体在医学和生物技术的许多领域受到高度关注，尽管纳米抗体的发现一直受到费力的筛选技术的限制。在此，研究人员展示了将通过测序连接B细胞受体与抗原特异性（LIBRA-seq）成功应用于免疫羊驼，以快速鉴定源自重链抗体的抗原特异性纳米抗体。研究人员在两种不同的疾
纳米抗体在医学和生物技术的许多领域受到高度关注，尽管纳米抗体的发现一直受到费力的筛选技术的限制。在此，研究人员展示了将通过测序连接B细胞受体与抗原特异性（LIBRA-seq）成功应用于免疫羊驼，以快速鉴定源自重链抗体的抗原特异性纳米抗体。研究人员在两种不同的疾病背景下验证了用于纳米抗体发现的LIBRA-seq（nbLIBRA-seq）。首先，研究人员从单只羊驼血样中鉴定出超过300个针对人转铁蛋白受体（TfR1）的抗原特异性重链抗体。其次，研究人员测试了nbLIBRA-seq在筛选文库中使用多种抗原的效率。利用来自相关的呼吸道合胞病毒（RSV）和人偏肺病毒（hMPV）的融合糖蛋白，研究人员恢复了1,125个表达抗原特异性重链的B细胞。结果表明，nbLIBRA-seq具有快速鉴定针对多种不同靶标的抗原特异性重链抗体的潜力，这一能力对于基于纳米抗体的治疗药物的高效开发至关重要。
纳米抗体（nanobody）是源于骆驼科动物和鲨鱼体内仅重链抗体（heavy-chain-only antibodies）的单域抗体，是最小的天然抗原结合片段，具有高稳定性、强组织穿透力、良好的亲水性和低免疫原性等优势，在治疗、诊断和基础研究中具有重要价值。然而，纳米抗体发现技术长期依赖展示文库筛选，通常一次只能针对单一抗原，流程繁琐、耗时且难以在单细胞水平直接将序列与抗原特异性大规模关联，这一方法学空白限制了抗原特异性纳米抗体的规模化解析和高效开发。为突破此瓶颈，研究人员将通过测序连接B细胞受体与抗原特异性（LIBRA-seq）技术改进为适用于羊驼重链抗体发现的方法，即nbLIBRA-seq，以实现高通量、多靶标的抗原特异性纳米抗体鉴定。
研究人员在两只免疫羊驼上建立了nbLIBRA-seq流程，分别针对人转铁蛋白受体（TfR1/CD71）和呼吸道合胞病毒（RSV）与人偏肺病毒（hMPV）的融合（F）糖蛋白。通过流式分选富集抗原特异性B细胞，结合单细胞B细胞受体（BCR）测序和抗原DNA条形码计算，获得数百个抗原特异性重链抗体序列，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、表面等离子体共振（SPR）和受体内部化实验等验证其结合与功能。结果显示，nbLIBRA-seq不仅能从单个血样中快速鉴定针对单一靶标的特异性重链抗体，还能在同一筛选中同时针对多个抗原或抗原变体进行发现，显示出较高的通量和通用性。
用于开展研究的主要关键技术方法包括：两只雌性羊驼由Turkey Creek Biotechnology免疫，一只免疫CD71，另一只免疫RSV F和hMPV F蛋白；将生物素化且偶联独特DNA条形码的抗原与羊驼外周血单个核细胞（PBMCs）孵育，通过流式分选富集IgG（亚类2+3）阳性、VHH阳性且抗原结合的B细胞；利用10× Genomics单细胞V(D)J测序平台获得重链B细胞受体序列，同时通过抗原条形码的唯一分子标识符（UMI）计数计算每个B细胞的抗原特异性；使用羊驼特异性引物进行靶向扩增，并计算LIBRA-seq评分（LSS）筛选候选抗体；将候选纳米抗体表达为与人IgG1 Fc融合的重链抗体，通过ELISA、SPR和T细胞内部化实验验证其结合与功能。
研究结果部分：
**Adaptation of LIBRA-seq for identification of alpaca heavy-chain antibodies**：研究人员设计了识别IgG2/3和VHH双阳性、且与生物素化抗原结合的B细胞的流式分选策略，并开发了羊驼特异性BCR扩增引物，结合抗原DNA条形码技术，成功建立了适用于羊驼重链抗体发现的nbLIBRA-seq流程，可同时获得抗体序列和抗原特异性信息。
**Elicitation of CD71-specific antibodies through alpaca immunization**：对羊驼进行七次CD71胞外域免疫后，血浆ELISA显示免疫后抗CD71抗体显著升高，而针对无关抗原的结合很低；斑点印迹实验提示部分抗体识别构象表位，说明羊驼成功产生了特异且强烈的CD71免疫应答。
**Discovery of CD71 nanobodies using nbLIBRA-seq**：nbLIBRA-seq运行经严格过滤后获得362个抗原特异性B细胞，其中超过300个预测针对CD71。基于LSS选择4个先导候选进行表达，ELISA确认其与CD71的结合；在Jurkat T细胞内部化实验中，TFR1NBLS-01和TFR1NbLS-02表现出与阳性对照OKT9相当或更强的TfR1内部化能力，证明了nbLIBRA-seq发现的抗体具有功能活性。
**Application of nbLIBRA-seq for simultaneous discovery of antigen-specific nanobodies against diverse targets**：为验证多抗原同时筛选能力，研究人员对另一只羊驼免疫RSV F和hMPV F蛋白，并使用每个抗原两个独特条形码提高特异性。nbLIBRA-seq共获得3,296个B细胞，其中716个对RSV F阳性、460个对hMPV F阳性，且对阴性对照BG505无阳性信号。选择29个候选表达，19个经ELISA确认为阳性；SPR显示RSV F抗体表观亲和力约为100 pM至3.5 nM，hMPV F抗体约为1 nM至100 nM。值得注意的是，部分hMPV反应性纳米抗体也能结合含临床耐药突变D280N的hMPV F蛋白，表明该技术可用于筛选具有广谱性的抗体。
讨论部分总结：nbLIBRA-seq发现的纳米抗体在V基因使用和CDR3长度上反映了羊驼免疫球蛋白库的特征，较长的CDR3可能有利于接触隐蔽表位。与展示技术相比，nbLIBRA-seq无需构建和维护展示文库，可在数天内获得多样化的抗原特异性序列，并能同时筛选多个抗原或变体，有利于发现交叉反应性纳米抗体并支持多特异性抗体工程。该研究的限制主要在于生物素化抗原-链霉亲和素复合物可能增加B细胞多聚体比例，但可通过流式门控和优化细胞浓度缓解。
研究结论部分可翻译为：nbLIBRA-seq能够快速鉴定针对多种不同靶标的抗原特异性重链抗体，这一能力对于高效开发基于纳米抗体的治疗药物至关重要。
