乳酸菌 _F. sanfranciscensis_ 在合成小麦酸面团培养基中损害酵母 _M. humilis_ 的适合度

《Applied and Environmental Microbiology》：Lactic acid bacterium F. sanfranciscensis impairs fitness of yeast M. humilis in a synthetic wheat sourdough medium

　　

摘要
酸面团发酵剂包含简单的微生物群落，通常由少数几个细菌物种和一至两种酵母物种组成。酵母 _Maudiozyma humilis_ 与乳酸菌 _Fructilactobacillus sanfranciscensis_ 常在酸面团发酵剂中共同出现，且曾被推定为存在一种由葡萄糖交叉喂养（cross-feeding）维系的营养关系。然而，已有研究指出缺乏证据证明酵母菌株会消耗 _F. sanfranciscensis_ 产生的葡萄糖。研究人员在一种合成小麦酸面团培养基（WSSM）中探究了 _M. humilis_ 与 _F. sanfranciscensis_ 酸面团分离株之间的相互作用，该培养基使研究人员能够控制底物组成并使用流式细胞术（flow cytometry）对活细胞和死细胞进行计数。研究发现，在与 _F. sanfranciscensis_ 共培养时，_M. humilis_ 的适合度低于单独生长时。对消耗后培养基（spent medium）组成的分析揭示了 _M. humilis_ 依赖葡萄糖而非麦芽糖进行生长。预测共培养代谢物含量与实际测量值的比较还揭示，_F. sanfranciscensis_ 在共培养中消耗的麦芽糖少于单独生长时。研究人员首次检测了 _M. humilis_ 与 _F. sanfranciscensis_ 之间潜在的氨基酸交叉喂养，并发现在这一配对中，_F. sanfranciscensis_ 是氨基酸的主要生产者。研究人员的发现表明，_M. humilis_–_F. sanfranciscensis_ 相互作用很可能是中性的，甚至是竞争性的，其中 _F. sanfranciscensis_ 的菌株特性对观察到的细菌优势和消耗后培养基代谢物组成起着决定性作用。

# 论文解读：乳酸菌 _Fructilactobacillus sanfranciscensis_ 对酵母 _Maudiozyma humilis_ 适合度的影响

## 一、研究背景与问题提出

酸面团（sourdough）是制作传统酸面团面包的基础发酵剂，由面粉和水经反复更新（refreshment）而形成的稳定微生物生态系统。I型酸面团发酵剂中的微生物群落较为简单，通常仅包含一至两种酵母和数种细菌，总数不超过六个物种。其中，酵母 _Maudiozyma humilis_（曾用名 _Kazachstania_ 或 _Candida humilis_）是仅次于酿酒酵母（_Saccharomyces cerevisiae_）的第二常见酸面团酵母物种，而乳酸菌（lactic acid bacterium, LAB）_Fructilactobacillus sanfranciscensis_ 则是酸面团中最具代表性的异型发酵乳酸菌。两者在I型酸面团发酵剂中的高频共现已有大量文献记载。

长期以来，学界普遍接受的假说认为 _M. humilis_ 与 _F. sanfranciscensis_ 之间存在由葡萄糖交叉喂养（glucose cross-feeding）支撑的营养互利关系。其理论基础在于：_M. humilis_ 是一种麦芽糖阴性（maltose-negative）酵母，尽管麦芽糖是面团中最丰富的小分子糖，它却无法直接利用；而 _F. sanfranciscensis_ 组成型表达麦芽糖磷酸化酶（maltose phosphorylase），可将麦芽糖分解为葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，释放出的葡萄糖理论上可供酵母利用。然而，关键问题在于——**至今尚无明确的实验证据表明 _M. humilis_ 确实消耗了 _F. sanfranciscensis_ 所产生的葡萄糖**。近期研究甚至发现，在由专性异型发酵乳酸菌单独发酵的面团中葡萄糖水平反而升高，而在与 _M. humilis_ 共发酵的面团中并未观察到葡萄糖被酵母消耗的证据；且所有受试酵母菌株在与乳酸菌共培养时其适合度均显著降低，而乳酸菌的适合度则几乎不受酵母存在的影响。此外，关于酸面团中的氨基酸交叉喂养（amino acid cross-feeding）——乳酸菌是否可能为酵母提供氨基酸——此前亦从未被探究。

因此，本研究旨在填补上述关键认知空白，核心目标为：（1）在可控的合成酸面团体系中检验葡萄糖交叉喂养假说；（2）首次系统检测 _M. humilis_ 与 _F. sanfranciscensis_ 之间是否存在氨基酸交叉喂养；（3）揭示共培养对双方适合度的真实影响。这一研究对于理解微生物群落中合作、共存与竞争的生态机制具有广泛的应用意义。

## 二、研究方法概览

研究人员收集了来源于法国和澳大利亚酸面团发酵剂的8株 _M. humilis_ 和8株 _F. sanfranciscensis_，构成8对酵母-细菌配对组合（其中澳大利亚菌株中有2对来自不同酸面团）。所有菌株在合成小麦酸面团培养基（wheat synthetic sourdough medium, WSSM）中以单独培养（monoculture）和全部64种配对共培养（co-culture）的方式于25°C下培养24小时。WSSM含有经高压灭菌的小麦蛋白胨基础盐溶液以及过滤除菌的葡萄糖（15 g/L）和麦芽糖（35 g/L）混合糖液。使用流式细胞术（flow cytometry）以SYTO 9/碘化丙啶（propidium iodide, PI）双荧光染色区分并计数活细胞与死细胞。消耗后培养基（spent medium）中的碳水化合物、有机酸及23种氨基酸浓度通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）测定。通过比较预测共培养代谢物浓度（基于单培养浓度加和，假定无相互作用）与实际测量值之间的差异来筛查潜在相互作用。此外还开展了pH调整培养基及糖组成调整培养基中的生长曲线验证实验。

## 三、主要研究结果

### 共培养对菌株适合度的影响

流式细胞术计数显示，在所有条件下活 _F. sanfranciscensis_ 细胞数量均最高。无论单独培养还是共培养，活的和死的 _F. sanfranciscensis_ 细胞数量均无显著差异。然而，与酵母单培养相比，共培养处理中活 _M. humilis_ 细胞数量显著减少（P < 0.001），而死酵母细胞数量相应增加，表明 _M. humilis_ 的适合度因 _F. sanfranciscensis_ 的存在而受损。值得注意的是，不同 _F. sanfranciscensis_ 菌株对酵母适合度的损害程度存在显著差异（P < 0.001）：例如 _F. sanfranciscensis_ Aus_KbB1使活 _M. humilis_ 细胞数量降低约一个对数级。

### 单培养代谢物分析揭示的碳源利用模式

_M. humilis_ 和 _F. sanfranciscensis_ 均消耗葡萄糖，但酵母消耗量更大。_F. sanfranciscensis_ 消耗了少量麦芽糖，而 _M. humilis_ 完全不消耗麦芽糖，确认了其对葡萄糖的专性依赖。仅 _F. sanfranciscensis_ 单培养积累了有机酸（乳酸产量为乙酸的两倍以上）。两种微生物均产生乙醇，但酵母产量远高于细菌；仅 _F. sanfranciscensis_ 产生甘露醇（mannitol）；仅 _M. humilis_ 产生丙酮酸（pyruvate）。两者均产生少量甘油（glycerol）和棉子糖（raffinose）。

### 单培养氨基酸代谢的对比

氨基酸代谢模式呈现三种类型：二者均消耗（天冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸）、二者均积累（脯氨酸、缬氨酸，仅对 _F. sanfranciscensis_ 显著）、以及 _F. sanfranciscensis_ 积累而 _M. humilis_ 消耗。后一类包括精氨酸（arginine）、谷氨酸（glutamic acid）、组氨酸（histidine）、丝氨酸（serine）和苏氨酸（threonine），它们在细菌单培养中显著高于基线水平，而在酵母单培养中显著降低。出乎意料的是，_F. sanfranciscensis_ 是氨基酸的主要生产者，而非酵母——这与先前在 _S. cerevisiae_ 与乳酸菌间观察到的情况相反。

### 预测与实际共培养代谢物浓度的差异

对于天冬酰胺、半胱氨酸和赖氨酸，预测与实际共培养浓度无显著差异，表明二者的消耗互不干扰。然而，实际共培养苏氨酸浓度低于预测值，提示酵母消耗增加或细菌生产减少；精氨酸水平则高于预测值，暗示相反趋势。酵母对亮氨酸（leucine）和异亮氨酸（isoleucine）的消耗在共培养中大于预测，而对甘氨酸（glycine）、蛋氨酸（methionine）和色氨酸（tryptophan）的消耗则减少。实际缬氨酸浓度显著低于预测值。碳水化合物方面，实际麦芽糖消耗显著多于预测，说明 _F. sanfranciscensis_ 在共培养中消耗了更多麦芽糖；乙醇产量在共培养中低于预期，甘油产量则增加；棉子糖和丙酮酸产量显著降低；细菌乙酸（acetate）产量显著高于预测值。

### 菌株效应与主成分分析（principal component analysis, PCA）

PCA显示前两个主成分可解释共培养间51.3%的变异。第一主成分主要与氨基酸相关，将法国菌株Fr_B10.CP109与Fr_B5.LB.102明显区分开；麦芽糖和乳酸呈负相关并影响第二维度。四株澳大利亚 _F. sanfranciscensis_ 菌株的聚类较为紧密，而法国菌株间几乎无重叠，表明菌株差异深刻影响共培养系统的代谢输出。

### 验证实验

pH调整实验表明，M. humilis Aus_OsrY1在以乳酸将pH调整为3、4、5、6的WSSM中生长不受影响，排除了pH降低是导致酵母适合度下降的主要原因。糖组成调整实验证实所有 _M. humilis_ 菌株均不能在仅含麦芽糖的培养基中生长，且在无葡萄糖时严重受损，与其基因组中缺乏MAL同源基因的发现一致。死 _F. sanfranciscensis_ 细胞数量与总氨基酸含量的相关性较弱（R2 = 0.10），表明氨基酸积累并非主要由细菌自溶（autolysis）引起。此外，麦芽糖消耗与乳酸产量呈正相关（R2 = 0.56），且二者与活细菌数量及培养基pH相关联，支持了麦芽糖代谢驱动乳酸菌生长的结论。

## 四、讨论与结论

本研究在合成酸面团培养基体系中未发现支持葡萄糖交叉喂养假说的证据——_M. humilis_ 无法利用麦芽糖，且在 _F. sanfranciscensis_ 存在时其适合度反而下降。氨基酸分析进一步表明，_F. sanfranciscensis_ 是氨基酸的净生产者而非消费者，这与 _S. cerevisiae_ 与乳酸菌间已知的氨基酸互养模式形成鲜明对比。因此，_M. humilis_ 与 _F. sanfranciscensis_ 之间的关系应被重新理解为中性（neutral）甚至竞争性（competitive）的生态互作，而非传统意义上的互利共生（mutualism）。_F. sanfranciscensis_ 的菌株特性在其中扮演决定性角色，其遗传背景在麦芽糖利用操纵子（_mapA_ 和 _mapB_）组成与表达上的差异可能是驱动菌株间表型变异的重要因素。

### 研究结论（原文翻译）

本研究探究了酸面团分离株 _M. humilis_ 与 _F. sanfranciscensis_ 之间相互作用的性质及其潜在机制。通过使用合成酸面团培养基，研究人员得以同时对活细胞和死细胞以及与非交叉喂养机制相关的关键碳氮化合物进行定量。数据表明，这一酵母-细菌相互作用很可能是中性的，甚至是竞争性的，且 _F. sanfranciscensis_ 的菌株特性对观察到的细菌优势和消耗后培养基代谢物组成起着决定性作用。在 _F. sanfranciscensis_ 存在下观察到的 _M. humilis_ 死亡率增加，可能部分可由葡萄糖或特定氨基酸的竞争来解释。本研究为此前在面团体系中进行的研究提供了一个重要的比较基准。未来研究应关注酵母与细菌之间直接细胞接触对其相互作用的影响。本研究对一个核心酸面团跨界配对提供了有益的观察，可被用于调控面包制作结果，同时也为理解微生物群落如何通过非合作性途径实现稳定作出了贡献。