《Genes》：Prime Editing for Precision Genetic Medicine: A Systematic Review of Technologies, Delivery, and Therapeutic Applications
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背景：Prime editing已从一种基于CRISPR的"搜索-替换"精确序列修饰方法，迅速发展为一个多样化的基因组编辑技术家族。本系统评价梳理了prime editing的技术演进，重点关注编辑器架构、向导RNA工程、递送、治疗应用、计算方法以及新兴能力。
背景：Prime editing已从一种基于CRISPR的"搜索-替换"精确序列修饰方法，迅速发展为一个多样化的基因组编辑技术家族。本系统评价梳理了prime editing的技术演进，重点关注编辑器架构、向导RNA工程、递送、治疗应用、计算方法以及新兴能力。方法：系统检索PubMed和Web of Science数据库，纳入将prime editing作为实质性实验、技术、计算、递送或治疗组成部分的研究。经去重和筛选后，对候选研究依据预设的纳入排除标准进行人工复筛。排除综述、勘误、植物及细菌研究、无实质性prime editing成分的常规CRISPR或碱基编辑研究以及其他不相关记录。最终纳入294项研究进行系统证据综合。由于编辑器架构、靶点、实验模型、结局指标和报告方式存在显著异质性，采用系统图谱和定性主题分析而非荟萃分析对文献进行综合。结果：证据表明，prime editing已从最初的Cas9切口酶–逆转录酶–prime editing向导RNA（pegRNA）架构迅速多元化，通过pegRNA设计、Cas和逆转录酶工程、DNA修复调控、递送、计算设计以及日益复杂的序列修饰等方面的改进不断发展。治疗研究涵盖疾病建模、致病变异纠正、离体应用和直接体内编辑；然而，高编辑效率并不必然转化为功能或治疗性挽救。大片段序列插入和替换策略进一步拓展了prime editing的能力，尽管这些方法在效率、保真度、货物递送和基因组安全性方面仍面临巨大挑战，成熟度不及小片段序列纠正。结论：Prime editing已发展成为一个多功能的精准基因组编辑平台，但证据基础仍高度异质且主要处于临床前阶段。向遗传医学的转化需要在不同靶点和细胞类型的可重复性、向临床相关组织的递送、产物纯度、基因组安全性以及有意义的功能获益验证等方面取得进展。新兴的大片段编辑方法拓宽了prime editing的潜在范围，但应与已积累充分实验和治疗证据的技术加以区分。
1 引言
基于CRISPR的基因组编辑技术的发展已深刻改变了实验遗传学，并为纠正致病性遗传变异创造了新的机遇。传统CRISPR–Cas9核酸酶产生靶向性DNA双链断裂（DSB），随后由内源性DNA修复途径进行修复。尽管DSB依赖性编辑在基因破坏方面效果显著，但常产生异质性插入缺失产物，且难以实现精确序列替换。同源定向修复（HDR）可引入确定性的序列改变，但通常需要外源性供体DNA模板，并受细胞DNA修复活性和细胞周期状态的强烈影响。碱基编辑（base editing）通过实现无DSB的选择性核苷酸替换而迈出重要一步；然而，传统碱基编辑器可直接引入的核苷酸变化类别有限，且可能产生旁观者编辑（bystander edits）。这些局限性催生了对一种更通用系统的需求，该系统能够在无需DSB或传统供体DNA模板的条件下精确重写基因组序列。Prime editing（PE）于2019年作为一种"搜索-替换"基因组编辑策略被提出，能够将新的遗传信息直接写入指定的基因组位点。原始系统将Cas9 H840A切口酶（nCas9）与工程化逆转录酶（RT）融合，并配合一条prime editing向导RNA（pegRNA）。pegRNA既引导编辑器至基因组靶点，又含有一个包含引物结合位点（PBS）和编码目标序列改变的逆转录模板（RTT）的3′延伸段。靶DNA链被切割后，暴露的基因组3′端与PBS杂交，启动RTT的逆转录。随后DNA中间体的加工和修复可将编程序列整合至基因组DNA中。原始系统实现了全部12种可能的单碱基替换，以及靶向插入和缺失，无需DSB或外源性供体DNA模板。
2 材料与方法
本系统评价依据PRISMA 2020框架开展并报告。于2026年8月1日以"Prime Editing"为检索词系统检索PubMed和Web of Science数据库，分别获得1892条和1912条记录（去重及初步筛选前共3804条）。经EndNote去重和预筛选排除后，2241条记录进入PRISMA研究筛选流程。纳入标准为：prime editing构成实验、技术、计算、递送或治疗研究的实质性组成部分。排除综述、荟萃分析、社论、会议摘要、勘误、预印本、重复发表以及无prime editing实质性成分的常规CRISPR或碱基编辑研究。经标题和摘要筛选排除865条记录后，对478项候选研究进行详细资格评估。在修订过程中，对所有478项候选记录依据预设标准进行人工复筛，最终排除184项记录，剩余294项研究纳入系统证据综合。由于纳入研究在编辑器架构、基因组靶点、实验模型、递送策略和报告结局方面存在显著异质性，采用系统图谱和定性主题分析进行证据综合，未进行荟萃分析。数据提取涵盖出版特征、PE架构（PE1、PE2、PE3、PE3b、PE4、PE5、PEmax、PE6、PE7、PE8及twinPE）、Cas及编辑器修饰、RT工程、pegRNA设计、DNA修复调控、递送方式、实验模型、治疗应用、计算或AI引导方法以及新兴或大规模编辑策略。研究被分为非互斥的主题类别，包括prime editing、逆转录酶、pegRNA、Cas修饰、聚合酶、递送、治疗、AI/计算以及未来/新兴技术。在治疗性研究中，对序列纠正与功能性挽救进行了明确区分，后者定义为疾病相关分子、细胞、生理或机体水平结局的实验性改善。
3 结果
3.1 证据格局与技术发展
在纳入的294项研究中，1项发表于2019年，随后2020年5项、2021年26项、2022年44项、2023年47项、2024年44项、2025年74项，截至2026年8月11日检索日期为53项。其中127项（43.2%）发表于2025年或2026年前八个月，表明相当大比例的证据基础为近期产出。主导分类为prime editing技术或方法学，涵盖272项研究（92.5%）。在重叠的主题分类中，90项研究（30.6%）涉及治疗应用，79项（26.9%）涉及pegRNA设计或优化，51项（17.3%）研究递送，45项（15.3%）涉及Cas修饰。较小但日益重要的组成部分包括15项（5.1%）计算或AI相关研究、14项（4.8%）RT工程研究、5项（1.7%）未来或新兴技术研究以及2项（0.7%）DNA聚合酶相关研究。方法学扩展的同时，对产物质量和基因组安全性的关注也日益增加，研究已涉及pegRNA非依赖性脱靶效应、脱靶编辑鉴定方法以及PE相关的潜在表观遗传学改变。
3.2 Prime Editor架构的演进
PE的演进涉及原始系统几乎所有组件的改良，包括RT、Cas蛋白、pegRNA、次级链切割策略及细胞DNA修复环境。由此产生的系统应视为互补的架构分支，而非每个新PE世代简单取代前代的线性序列。原始PE1结合H840A Cas9切口酶与莫洛尼鼠白血病病毒RT，PE2整合工程化RT以提高编辑活性。PE3添加切割非编辑链的第二向导RNA，可增加目标编辑但可能增加非预期插入缺失，而PE3b将次级切割置于仅在目标编辑安装后才发生的位置。PE4和PE5通过瞬时错配修复（MMR）抑制——利用显性负性MLH1（MLH1dn）——显著提高了编辑效率，而额外的蛋白和表达优化产生了PEmax。Rad51 DNA结合域的加入、双向引物策略以及工程化pegRNA表达系统进一步扩展了架构多样性。蛋白质进化和噬菌体辅助进化产生了PE6家族，包括紧凑且活性更高的RT和Cas变体。结构信息引导的AI重设计产生了PE8家族，将编辑器工程从理性突变和实验室进化拓展至计算蛋白重设计。twinPE利用两条靶向相反链的pegRNA生成互补编辑中间体，实现了较大DNA序列的可编程缺失、替换、整合和倒位。这些系统的性能高度依赖于靶序列、目标编辑类型、pegRNA设计、细胞环境、所需产物纯度和递送限制，因此不存在普适的最优PE架构。
3.3 pegRNA与逆转录酶工程
pegRNA和RT工程是PE优化的主要轴心。pegRNA执行双重功能：其间隔序列将编辑器引导至基因组靶点，其3′延伸段包含PBS和RTT以启动逆转录并编码目标序列改变。早期计算设计工具——如Easy-Prime——将机器学习融入PE设计框架，实现了候选pegRNA的系统性评估。Csy4介导的pegRNA加工提高了PE活性。RNA结构工程提供了多种互补策略以稳定易降解的3′延伸段：RNA G-四链体结构增强PE效率，外切核糖核酸酶抗性RNA（xrRNA）基序同样改善了pegRNA性能。工程化pegRNA（epegRNA）的开发是一项重要进展：Nelson等通过在pegRNA 3′端引入结构化RNA基序，保护延伸段免于降解，在多种人类细胞系和原代成纤维细胞中显著提高了编辑效率。PBS长度、序列以及RTT长度、组成和二级结构的优化具有根本的靶点依赖性。错配pegRNA可改善目标编辑并减少插入缺失形成。pegRNA工程还可影响产物质量：改良pegRNA已被设计用于减轻支架衍生的PE副产物。RT工程方面，PE6家族的噬菌体辅助进化产生了针对不同编辑环境优化的紧凑RT变体，而PE8则通过结构信息AI重设计改善了RT活性、蛋白稳定性和表达之间的平衡。PE复合物的结构表征揭示了Cas9–RT架构如何容纳pegRNA引导的逆转录，为RT性能对RNA和DNA底物构象的内在依赖性提供了机制基础。
3.4 Cas工程与DNA修复调控
Cas工程和细胞DNA修复通路调控是扩展PE靶向范围、提高编辑效率和产物纯度的互补策略。传统SpCas9基础PE的主要局限在于需要适当位置的PAM序列。PAM灵活的SpCas9变体通过改变PAM识别显著扩展了PE的靶向范围。基于Cas12a的PE架构利用更小的Cas蛋白、富含T的PAM识别以及多重靶向潜力提供了另一途径。Cas工程还可改善产物纯度："真正"的Cas9切口酶通过额外修饰HNH结构域降低双链切割活性，在与PE2和PE3整合时减少了非预期插入缺失。核酸酶基础PE在难编辑靶点处可提高编辑效率，但增加了修复产物的复杂性。在DNA修复方面，MMR是PE结果的关键决定因素。CRISPR干扰筛选鉴定出MMR是高效PE的主要障碍。利用MLH1dn瞬时抑制MMR形成了PE4和PE5的基础。最近，Park等利用生成式蛋白设计方法产生了紧凑的MLH1小结合蛋白（MLH1-SB），整合后产生了PE-SB平台，在培养细胞和体内均提高了编辑效率。此外，DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）和DNA聚合酶θ（Polθ）的联合药理学抑制改善了PE3、PE5、PE7及配对pegRNA系统的编辑精度，表明经典和替代末端连接途径均影响PE产物分布。次级链切割进一步说明了编辑器架构与修复之间的相互作用：PE3通过切割非编辑链使修复偏向新合成链，但PE3b通过定位次级切割使其仅在目标序列成功安装后才发生，从而减少插入缺失。
3.5 递送策略
高效递送仍是prime editing与广泛治疗应用之间的主要障碍之一。在最终证据集中，51项研究（17.3%）涉及递送。活性PE系统可能需要大型Cas-RT融合蛋白、一条或多条pegRNA以及可能的额外切割向导或修复调控组件，构成不同寻常的递送挑战。腺相关病毒（AAV）是体内PE的主要平台之一，但传统Cas9–RT编辑器超过单个AAV载体的包装容量。分裂编辑器架构通过将RT从Cas靶向组件中分离，改善了双AAV递送。Davis等系统性解决了多个递送瓶颈，利用双AAV系统在小鼠脑、肝脏和心脏中实现了高效PE。减小编辑器尺寸提供了另一种方案：PE6家族的紧凑RT编辑器在保持或提高编辑活性的同时减小了整体尺寸，而CjCas9等较小Cas蛋白的工程化进一步提高了AAV兼容性。工程化病毒样颗粒（eVLPs）可包装prime editor核糖核蛋白（RNP）复合物而非编码DNA，提供了一种瞬时、无转基因的递送策略。RNA和RNP递送避免了编辑器编码DNA的持续表达，但引入了涉及RNA稳定性、制造和配方的挑战。优化脂质纳米颗粒（LNP）配方已被用于递送基因组编辑器RNP。离体和体内应用的递送要求存在根本差异：离体编辑允许在移植前对编辑群体进行表征，而体内编辑要求编辑系统在给药后到达相关组织和细胞群体。紧凑编辑器、分裂蛋白、稳定化pegRNA、RNP和替代载体分别针对递送问题的不同方面，而非构成通向最优递送平台的单一线性进程。
3.6 治疗应用与功能性挽救
治疗应用是最终证据集中第二大类主题，90项研究（30.6%）涉及疾病相关变异、疾病模型或潜在治疗应用，涵盖代谢、肺部、血液、神经肌肉、心血管、视网膜、神经及其他遗传性疾病。然而，这些研究代表了显著不同的转化证据水平。因此，需对疾病相关DNA序列纠正、分子或细胞功能恢复以及体内疾病表型挽救进行核心区分。早期治疗研究表明，PE可在患者来源细胞和类器官中纠正致病变异。在代谢和肝脏疾病方面，PE在代谢性肝病小鼠模型中靶向致病等位基因，并纠正了与苯丙酮尿症相关的常见PAH p.Arg408Trp变异。囊性纤维化（CF）提供了从基因组纠正向功能性挽救进展的有力例证：PE在人气道上皮细胞中纠正CFTR突变，CFTR活性恢复提供了超越序列纠正的功能终点。在血液疾病方面，PE被用于将HBG1/2启动子中的抑制基序转化为激活基序以增加γ-珠蛋白表达。在杜氏肌营养不良（DMD）中，高容量腺载体递送先进PE系统实现了无筛选基因修复及抗肌萎缩蛋白合成的挽救。视网膜疾病提供了器官水平功能性挽救的最有力证据之一：Qin等将PAM宽松PE与体内递送相结合，纠正了退变小鼠视网膜中的致病突变，并将基因组编辑延伸至疾病相关蛋白功能恢复、光感受器保护、视网膜生理反应改善以及视觉依赖行为改善。Sousa等利用体内PE纠正了儿童交替性偏瘫小鼠模型中的致病Atp1a3变异——AAV9介导的中枢神经系统编辑恢复了ATP酶活性，改善了阵发性发作、运动异常和认知缺陷，并显著延长了寿命。据此，治疗证据可组织为日益严格的终点递进：（i）疾病相关序列编辑；（ii）RNA或蛋白表达恢复；（iii）疾病相关细胞功能挽救；（iv）体内组织或生理挽救；（v）机体水平疾病表型或生存改善。
3.7 计算与AI引导设计
计算方法随着PE设计空间的扩展而日益重要。15项研究（5.1%）被归类为计算或AI相关。早期计算挑战是有效pegRNA的选择：单个目标编辑通常可通过众多间隔序列、PBS、RTT和次级切割向导组合生成，但编辑效率差异显著。Easy-Prime将机器学习融入集成PE设计框架。Mathis等开发了深度学习模型以同时预测PE效率和产物纯度，而序列特征和DNA修复决定因子被用于预测插入效率。Transformer方法如DTMP-prime进一步扩展了预测pegRNA活性的机器学习方法。基因组和染色质环境的整合成为重要进展——跨不同染色质环境训练的机器学习模型表明，局部染色质状态提供了超越pegRNA序列的额外信息。PRIDICT2.0和ePRIDICT进一步规范化了不同实验环境下的系统性pegRNA设计。在特异性方面，TAPE-seq被开发为预测prime editor全基因组脱靶效应的细胞方法。AI引导的编辑器工程代表了从计算预测到分子设计的最直接转变：AI生成的MLH1结合蛋白被开发用于抑制MMR并改善PE；PE8家族利用结构信息AI重设计实验室进化RT，改善RT活性、蛋白稳定性和表达之间的平衡。总体而言，计算文献呈现一种递进：经验筛选→预测建模→情境感知预测→AI引导分子设计。新兴范式是迭代的设计–构建–测试–学习循环。
3.8 新兴及大规模基因组编辑
PE的一个主要前沿是从局部序列纠正向越来越大规模的可编程基因组写入过渡。系统性证据集包含一组技术多样的研究，涉及配对pegRNA、大片段缺失和替换、重组酶辅助整合、扩展编辑几何结构、替代聚合酶及其他新兴基因组写入方法。PRIME-Del利用配对PE反应实现可编程基因组缺失。twinPE通过两条靶向相反链的pegRNA生成互补编辑中间体，实现更大的可编程缺失、替换、整合和倒位。PE与位点特异性整合酶和重组酶的结合进一步扩展了货物容量：PASTE将PE介导的整合位点安装与丝氨酸整合酶偶联，实现大DNA货物的靶向插入。EXPERT通过克服pegRNA引导切割的常规位置限制，扩展了PE效率和大片段编辑范围。四重pegRNA编辑协调四条pegRNA以支持可编程大片段基因组插入。PE介导的微同源修复促进了较大基因组DNA片段的高效替换。非病毒靶向整合在原发性人类T细胞中实现，无需常规DSB介导的整合。PE基础倒位策略已开发用于在越来越大的序列间隔上生成精确基因组倒位。一个机制上不同的新兴方向是用DNA依赖性DNA聚合酶（DNAP）活性替代以RT为中心的反应。CODE（嵌合寡核苷酸引导编辑）提供了另一种将可编程靶向与DNA聚合酶介导合成相结合的策略。然而，仅2项纳入研究（0.7%）被归类为聚合酶相关，凸显该分支的早期阶段。这些技术共同拓宽了PE的概念边界，但它们在机制、实验验证、递送要求和转化成熟度方面存在显著差异。
4 讨论
本系统评价绘制了prime editing从2019年问世至2026年8月11日的发展图谱。在纳入的294项研究中，PE已从确定的Cas9切口酶–RT系统演变为一个模块化基因组编辑平台，其中Cas蛋白、RT、pegRNA、DNA修复环境和递送策略均可独立改良。证据因此支持PE发展的多维而非线性模型：较晚编号的编辑器不应被假定具有普适优越性，性能取决于目标编辑类型、基因组靶点、pegRNA设计、细胞类型、递送方法以及效率与产物纯度之间的期望平衡。三个结论从证据中浮现：首先，PE组件的优化日益相互依赖——pegRNA结构和稳定性影响呈递给RT的底物，Cas选择决定靶向可及性和切割几何结构，细胞修复途径影响编辑中间体的修复结果，而递送决定优化后的编辑器能否到达疾病相关细胞。其次，编辑效率不等同于治疗获益——序列纠正提供分子编辑证据，而更强的治疗证据需要分子或细胞功能恢复以及最终组织生理或疾病表型的改善。第三，计算设计和新兴大规模编辑架构正在同时扩展PE系统的设计方式和可编程基因组改变的类型。递送仍是分子优化与治疗应用之间的主要障碍。编辑效率、产物纯度和基因组安全性应被综合考虑。AAV基础方法已展示体内PE同时突显了货物尺寸限制；紧凑编辑器架构可部分解决此问题；eVLPs、化学稳定化pegRNA和非病毒递送为瞬时编辑器暴露提供了机会。治疗证据进一步表明递送和编辑效率是中间而非最终终点。疾病特定功能终点应替代通用的编辑效率阈值来评判治疗性PE。计算和AI引导方法正在将PE从经验优化转变为预测性设计，未来目标应是多目标计算优化——整合效率、产物纯度、特异性、基因组完整性、编辑器尺寸、细胞环境和递送限制。大规模架构应依据已实验证明的内容而非理论编辑容量来解读。
5 结论
本系统评价涵盖294项研究，表明prime editing自2019年问世以来已从确定的Cas9切口酶–RT编辑系统迅速演进为一个多样化且日益模块化的精准基因组修饰平台。证据表明，这一发展最好理解为相互作用组件——包括Cas蛋白、pegRNA、逆转录酶、DNA修复调控和递送系统——的多元化，而非越来越优越的PE世代的线性递进。治疗文献前景可期但仍以临床前研究为主体。编辑效率不应等同于治疗效能；序列纠正是关键第一步，但更有力的证据需要证明编辑恢复了分子功能、产生了疾病相关的细胞或生理挽救并最终改善了机体水平表型。递送仍是临床转化最重要的障碍之一。PE的尺寸和多组分特性催生了互补解决方案，包括紧凑编辑器、分裂病毒系统、mRNA和化学稳定化pegRNA、脂质纳米颗粒、eVLPs及离体编辑。计算和AI引导方法正开始将PE从经验优化转变为预测性设计——pegRNA选择模型、基因组背景预测、特异性评估和AI引导的编辑器组件工程为集成编辑器设计提供了新兴基础。配对和混合PE架构正将精准编辑从单个核苷酸改变扩展至更大的缺失、替换、整合、倒位以及潜在的基因或区域规模基因组写入。这些能力之所以重要，是因为许多疾病基因含有大量不同的致病变异，可能通过替换更大确定基因组区域而非突变特异性纠正来解决。然而，更大的编辑能力并不意味更高的治疗成熟度。综合而言，证据支持prime editing核心问题的转变：领域正从简单追问哪个编辑器产生最高编辑效率，转向确定需要何种基因组改变以恢复生物学功能以及哪种编辑器架构、向导设计、细胞环境和递送系统组合能够安全地实现这一结果。这一从序列编辑向结局驱动的精准基因组工程的转变，可能最终决定prime editing在遗传医学中的角色。
