RNA结合蛋白FXR1通过转录后调控HMGB2 mRNA稳定性维持人神经祖细胞（NPCs）的神经发生潜能

《Stem Cell Reports》：Post-transcriptional regulation maintains neurogenic potential of human neural progenitor cells

　　

越来越多的证据支持转录后调控（post-transcriptional regulation）在大脑发育中发挥重要作用；然而，其精确机制仍不清楚。本研究中，研究人员发现脆性X染色体常染色体同源物1（Fragile X autosomal homolog 1，FXR1），一种脑富集的RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP），对人类神经发生（neurogenesis）至关重要。FXR1缺失的人皮层神经祖细胞（neural progenitor cells，NPCs）增殖减少，且在分化过程中细胞周期退出（cell cycle exit）受损，导致神经元分化障碍。转录组学（transcriptomic）和共表达网络分析揭示FXR1是驱动神经分化的阶段特异性基因程序的协调者。高迁移率族蛋白B2（high-mobility group protein B2，HMGB2），一种干细胞中的主转录调控因子，是FXR1的直接靶标。FXR1和人类抗原R（Human antigen R，HuR，又称ELAVL1）共同调控HMGB2 mRNA，二者对mRNA稳定性相反的调控作用维持了人NPCs中HMGB2的水平。在FXR1缺失的NPCs中降低HMGB2水平可挽救NPC增殖和神经元分化。综上，这些发现确立了转录后调控是维持人NPCs神经发生潜能（neurogenic potency）的关键机制。

**论文解读：FXR1通过转录后调控HMGB2维持人神经祖细胞神经发生潜能的机制研究**

大脑发育需要精确调控神经祖细胞（neural progenitor cells，NPCs，即具有自我更新和分化能力的神经前体细胞）的自我更新、细胞周期退出和神经元分化。长期以来，转录水平的基因调控被认为是神经发育的核心机制，然而，转录后调控（post-transcriptional regulation，即RNA剪接、定位、稳定性及蛋白质翻译等RNA层面的调控）因其比转录调控更快速的特点，逐渐被认识到在细胞命运快速转变中发挥不可或缺的作用。RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs，即结合并调控RNA代谢的蛋白质）是转录后调控的关键执行者，其突变与智力障碍、孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）和脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）等神经发育疾病密切相关。然而，大多数RBPs在神经发育中的精确调控机制仍不清楚。FXR1（Fragile X autosomal homolog 1）是脑富集的RBP家族成员，其功能丧失在人类中不可耐受，在小鼠中导致新生死亡。尽管FXR1位于ASD易感位点染色体3q25-27，且被多组学和全基因组关联研究鉴定为精神分裂症的高置信度风险基因，但FXR1在人类皮层发育，尤其是皮层神经元分化中的功能一直未知。因此，探究FXR1在人类神经发生中的作用及其分子机制具有重要的科学意义。

研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在两个健康对照人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）系中构建了FXR1敲除（FXR1-KO）细胞系，通过双SMAD抑制法（dual SMAD inhibition，一种将多能干细胞诱导分化为神经细胞的经典方法）将iPSCs分化为NPCs和背侧前脑兴奋性神经元，系统研究了FXR1缺失对NPC增殖、神经元分化、形态发育和电生理功能的影响，并结合转录组学和共表达网络分析揭示了其分子机制。研究首次证明FXR1是人类NPC维持神经发生潜能所必需的转录后调控因子，FXR1通过与HuR拮抗调控HMGB2 mRNA的稳定性来控制NPC中HMGB2的水平，而降低HMGB2水平足以挽救FXR1缺失导致的神经发生缺陷。这一发现确立了转录后调控在人类神经发育中的关键地位，为理解神经发育疾病的发病机制提供了新视角，并提示FXR1-HMGB2轴可能成为潜在的治疗靶点。

**关键技术与方法**（约230字）：研究人员利用CRISPR-Cas9技术在来源于Coriell Institute的GM00498-4和WiCell的WC032i-6007-1两个健康对照iPSC系中构建FXR1-KO细胞系，另在WC031i-5907-6系中构建FXR1-3XFLAG敲入细胞系；通过双SMAD抑制法分化为NPCs和背侧前脑兴奋性神经元。采用RNA测序（RNA-seq）结合DESeq2进行转录组差异分析，利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和基因集变异分析（GSVA）识别共表达模块及其与发育阶段的关联；通过RNA免疫沉淀定量PCR（RIP-qPCR）验证FXR1与HMGB2 mRNA的直接结合；采用放线菌素D处理进行mRNA半衰期分析；利用多电极阵列（MEA）和遗传编码钙指示剂GCaMP7f进行神经元电生理功能评估；通过慢病毒（lentivirus）介导的shRNA敲低和过表达进行功能性挽救实验。

**研究结果：**

**FXR1是人NPC增殖和背侧前脑神经元正常分化所必需的：** 通过Ki67和EdU标记检测，FXR1-KO NPCs中增殖细胞比例显著降低；FXR1敲低（FXR1-KD）实验验证了该增殖缺陷。在分化1周时，FXR1-KO细胞中TUBB3⁺未成熟神经元减少44.3%，MAP2⁺神经元减少20.8%；至分化4周时，TUBB3⁺神经元减少36.5%，MAP2⁺神经元减少43.5%，成熟神经元标志物NeuN⁺细胞减少55.5%，表明神经元分化缺陷是持续性而非延迟性的。同时，FXR1-KO培养物中SOX2⁺ NPCs比例在分化4周时仍高达31.8%（对照组为7.8%），且其中46.7%仍呈Ki67⁺增殖状态（对照组仅8.3%），表明FXR1缺失导致NPCs细胞周期退出障碍。未检测到向胶质细胞命运转变的证据。凋亡分析显示，NPC阶段和分化1周时cleaved caspase-3水平无显著差异，但在分化4周时FXR1-KO神经元凋亡显著增加（25.9% vs. 11.6%）。

**FXR1缺失损害人神经元的形态和电生理发育：** 形态学分析显示，FXR1-KO MAP2⁺神经元在分化1周和4周时均表现为树突末端数、分支节点数和总神经突长度显著减少。多电极阵列（MEA）记录显示，FXR1-KO神经元在分化5周时平均放电频率和簇放电（burst）数量均显著降低。通过钙成像分析Synapsin启动子驱动的GCaMP7f荧光信号，进一步证实FXR1-KO单个神经元的活动事件数和簇放电数显著减少，排除了神经元数量减少对MEA结果的干扰。

**FXR1缺失导致跨分化阶段的基因表达程序紊乱：** 对NPC、分化1周和4周神经元进行RNA-seq分析，主成分分析（PCA）显示对照和FXR1-KO细胞在各阶段均呈现明显的基因型依赖性转录差异。差异表达基因（DEGs）在各阶段之间重叠极少，仅FXR1、BEX5、FAM50B、DMRTA2、ENSG00000290654和LINC02506在三个阶段均差异表达，表明FXR1缺失的转录效应具有强烈的阶段特异性。随着分化进展，DEGs数量逐渐增加。基因本体（GO）分析显示，NPC阶段DEGs富集于早期神经元谱系程序；分化1周时富集于有丝分裂细胞周期和神经元分化；分化4周时富集于突触形成、离子通道和神经元形态等成熟相关过程。基因集富集分析（GSEA）进一步表明，神经元分化相关通路在FXR1-KO NPCs和分化1周时呈负富集，而细胞周期相关通路在分化1周时呈正富集，说明细胞周期退出受阻；分化4周时突触功能和神经元成熟相关基因网络表达下调。

**共表达网络分析揭示FXR1缺失破坏的协调转录程序：** 利用跨三个分化阶段的DEGs进行WGCNA分析，鉴定出四个主要共表达模块（M1-M4）。M1模块基因在NPCs中高表达，随分化逐渐下调，富集于有丝分裂进程、染色质组织和早期神经发育程序；M2和M3模块富集于神经元发育和功能，在分化过程中逐渐上调但FXR1-KO中上调受阻；M4模块富集于钙信号和动作电位等成熟神经元功能，在对照4周神经元中高表达，但在FXR1-KO中未能上调。模块-性状关联分析表明，M1模块在FXR1-KO分化1周时抑制不足，而M2和M4模块与分化阶段的正常正相关性在FXR1-KO中减弱或消失，M4模块在分化4周时表现最为显著的降低，提示神经元成熟障碍。通过基因网络分析鉴定各模块中的枢纽基因（hub genes），M1模块中HMGB2（high mobility group box 2，一种染色质结合转录因子）、CDT1和NOTCH3为前三位的枢纽基因，其中HMGB2具有最高的模块内连接度。HMGB2 mRNA和蛋白水平在FXR1-KO NPCs和分化1周时均显著上调。NOTCH3抑制剂实验未能挽救FXR1-KO的神经元分化缺陷，提示NOTCH3上调更可能是分化障碍的下游后果而非上游驱动因素。

**FXR1直接结合并降低HMGB2 mRNA的稳定性：** RIP-qPCR实验在对照NPCs和分化1周神经元中均检测到FXR1抗体富集HMGB2 mRNA，而FXR1-KO中无此富集。利用内源FXR1基因C端敲入3XFLAG标签的iPSC系，以抗FLAG抗体进行RIP-qPCR进一步验证了FXR1与HMGB2 mRNA的直接结合。mRNA稳定性实验显示，在转录抑制剂放线菌素D处理后，对照NPCs中HMGB2 mRNA半衰期（T_1/2）为6.68小时，而FXR1-KO NPCs中延长至10.44小时，表明FXR1缺失导致HMGB2 mRNA稳定性增加。研究进一步发现，已知的mRNA稳定因子HuR在FXR1-KO NPCs中对HMGB2 mRNA的结合增加。过表达实验证实，HuR过表达可显著减少FXR1与HMGB2 mRNA的结合，反之FXR1过表达可减少HuR的结合，证明二者对HMGB2 mRNA存在拮抗调控关系。

**敲低HMGB2可挽救FXR1-KO NPCs的神经元分化缺陷：** 在FXR1-KO NPCs中利用慢病毒shRNA敲低HMGB2，可将NPC增殖水平恢复至对照水平；在分化4周时，HMGB2敲低显著减少了FXR1-KO中滞留的Ki67⁺SOX2⁺增殖性NPCs，增加了TUBB3⁺和MAP2⁺神经元比例，同时挽救了神经突长度和复杂度的形态学缺陷，增加了NeuN⁺成熟神经元数量。值得注意的是，HMGB2敲低不仅恢复了FXR1-KO在分化5周时的神经元放电频率和簇放电数量，甚至使这些指标超过对照水平，提示HMGB2的精确剂量对维持正常的神经元网络兴奋性至关重要。

**总结与结论：** 本研究通过多层面的实验证据，确立了FXR1作为人类NPC神经发生潜能的关键转录后调控因子。研究发现FXR1与HuR形成拮抗调控关系，共同控制HMGB2 mRNA的稳定性：FXR1通过直接结合HMGB2 mRNA促进其降解，而HuR则稳定该转录本。FXR1缺失导致HMGB2水平升高，使NPCs在分化过程中无法正常退出细胞周期，从而损害神经元分化和功能成熟；降低HMGB2水平足以挽救这些缺陷。该研究支持一个模型：在NPCs中，FXR1通过转录后机制主动抑制NPC富集转录本（如HMGB2），从而允许细胞在分化信号下正常退出细胞周期并进入神经元分化程序。这些结果与FXR1缺陷成年小鼠NPCs中的发现一致，提示该机制在物种间具有保守性。研究也存在若干局限性：未探究FXR1对抑制性中间神经元的影响；FXR1可能通过调控其他模块（M2、M3、M4）中的靶标影响成熟神经元功能；FXR1选择靶标的机制以及FXR1与HuR如何在HMGB2 mRNA上实现拮抗结合的具体分子机制尚待阐明；此外，基于iPSC的体外模型需结合体内研究进一步验证。

**研究结论：** 转录后调控是维持人NPCs神经发生潜能的关键机制，FXR1作为该调控网络的核心组分，通过与HuR拮抗调控HMGB2 mRNA的稳定性，确保NPCs在分化过程中正常退出细胞周期并完成神经元分化和功能成熟。