基于大规模Perturb-seq数据系统评估单细胞转录因子活性推断方法

《Briefings in Bioinformatics》：Benchmarking methods for inferring single-cell transcription factor activity using large-scale perturbation sequencing data

转录因子活性（transcription factor activity, TFA）并非仅由转录因子（transcription factor, TF）基因本身的表达水平决定，还受一系列转录后调控过程的调节。尽管已有大量计算方法通过构建基因调控网络（gene regulatory network, GRN）从单细胞转录组数据推断TFA，但该领域仍缺乏利用高质量实验数据对这些方法进行系统、统一评估的研究。在本研究中，研究人员利用大规模、高质量的单细胞扰动测序（Perturb-seq）数据集，对涵盖三种类别的八种主流TFA推断方法进行了全面评估：基于先验GRN、基于从头GRN以及基于整合GRN的方法。结果表明，采用整合GRN的metaTF在多个指标上表现最佳，包括TF覆盖率、对扰动细胞的预测准确性以及对扰动TF的预测准确性。在基于从头GRN的方法中，pySCENIC的预测准确性仅次于metaTF，但TF覆盖率较低；同时，基于先验GRN的decoupleR在所有评估指标中均排名靠前。进一步研究发现，重建的regulon在差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）中的富集程度、先验GRN和TFA评分算法的选择以及目标TF的扰动类型，都是影响TFA推断准确性的关键因素。该研究为TFA推断方法的应用与发展提供了实用建议。

单细胞转录因子活性推断方法的系统基准评测：基于Perturb-seq的大规模研究

**研究背景与意义**

转录因子（transcription factor, TF）是基因表达的关键调控因子，其活性（transcription factor activity, TFA）不仅取决于TF基因自身的mRNA水平，还受到翻译效率、翻译后修饰、亚细胞定位和蛋白质相互作用等一系列转录后调控机制的影响。因此，从转录组数据推断TFA主要依赖基因调控网络（gene regulatory network, GRN）的构建。GRN的基本单位是regulon，即特定TF与其靶基因之间的调控关系集合。虽然已有大量基于单细胞RNA测序（scRNA-seq）的TFA推断方法，但领域内缺乏使用高质量实验数据对这些方法进行系统、统一评估的研究。单细胞扰动测序（Perturb-seq）通过CRISPR递送靶向基因的sgRNA和条形码，可明确识别被遗传扰动的细胞，为TFA推断提供金标准。因此，研究人员利用大规模Perturb-seq数据对八种代表性TFA推断方法进行了系统基准评测，以填补这一空白，并为方法选择与发展提供依据。

**研究内容与主要结论**

研究人员从PerturBase数据库（2025年9月查询）筛选原始数据集，经严格质量控制后获得17个人源细胞系Perturb-seq数据集，包含174次单基因扰动，靶向135个独立TF。根据GRN信息来源，八种方法被分为三大类：基于先验GRN的decoupleR；基于从头GRN的pySCENIC、PISCES、hdWGCNA、scMINER；基于整合GRN的TIGER、metaTF、scRegulate。评估维度包括TF覆盖率、扰动细胞识别准确性、扰动TF识别准确性以及计算效率。结果表明，metaTF在TF覆盖率（99.4%）和多个预测准确性指标上均最优；pySCENIC预测准确性仅次于metaTF，但覆盖率仅47.7%；decoupleR在所有指标上排名靠前，且与metaTF预测相关性较低，具有互补性。进一步分析显示，regulon在DEGs中的富集程度越高，预测AUROC越高；先验GRN和评分算法的替换会显著改变预测性能；扰动方式和TF DNA结合域（DNA-binding domain, DBD）类别对基于从头GRN的方法影响较大，而decoupleR更为稳健。该研究为应用者提供了实用建议：资源充足时可优先选择metaTF；pySCENIC可作为不依赖先验知识的强选择；decoupleR使用ULM评分算法则具有低计算成本和稳健性优势。

**关键技术方法与数据来源**

样本队列来源为PerturBase数据库筛选得到的17个人源细胞系Perturb-seq数据集（174次单基因扰动，135个TF）。主要关键技术包括：使用scanpy和pertpy进行常规质量控制；使用mixscape算法排除扰动逃逸的假阳性细胞；使用E-test识别并去除弱效应扰动组；以AUROC、AUPRC、早期精确率（early precision, EP）和归一化秩（normalized rank, NRank）为评估指标；采用留一数据集分析排除数据集偏倚；用超几何检验评估regulon在DEGs中的富集；用多元线性回归和方差分析（ANOVA）控制扰动方式影响后检验TF DBD类别效应；同时记录各方法的运行时间和峰值内存。

**主要研究结果**

1. 基准数据集与TFA推断方法
研究人员基于PerturBase构建了包含17个高质量数据集的基准，涵盖135个TF的174次扰动，约占人类TF全谱的9.5%，DBD类别跨18类。扰动类型包括CRISPRa/ORF过表达产生的102个激活扰动和CRISPRi/CRISPR-KO产生的72个抑制扰动。统一预处理后，按GRN来源将八种方法分为先验、从头和整合三类。

2. TFA推断方法的性能
以AUROC/AUPRC评估扰动细胞识别，以NRank评估扰动TF识别。metaTF的平均AUROC为0.681，中位AUPRC为0.179，平均NRank为0.327，均显著优于其他方法。pySCENIC平均AUROC为0.645，中位AUPRC为0.146，平均NRank为0.352；decoupleR平均AUROC为0.597，中位AUPRC为0.102，平均NRank为0.413。留一数据集分析结果与全数据集一致。早期精确率分析中，仅metaTF、pySCENIC和hdWGCNA显著优于随机基线。相关性分析显示，metaTF与pySCENIC的预测准确性高度相关（相关系数0.80），而decoupleR与metaTF的相关性较低（相关系数0.29）。

3. Regulon富集分析
以TF IRF1为例，metaTF构建的IRF1 regulon在DEGs中的富集最显著（校正P=1.05e-11），高于pySCENIC（校正P=5.62e-08）和decoupleR（校正P=3.46e-06）。对全部regulon进行超几何检验后，metaTF通过检验的regulon数量最多、校正比值比（odds ratio, OR）最高。在metaTF、pySCENIC和decoupleR中，通过富集检验的regulon对应AUROC显著高于未通过者，表明regulon在DEGs中的富集是影响TFA推断准确性的关键因素。

4. 先验GRN的影响
对metaTF分别仅使用先验GRN或从头GRN时，AUROC均显著低于完整整合模型，说明两类信息对metaTF的最优性能缺一不可。对decoupleR，CollecTRI先验GRN显著优于TFLink；对scRegulate，ChIP-Atlas优于默认CollecTRI和TFLink；对TIGER，DoRothEA、ChIP-Atlas和CollecTRI之间无显著差异。因此，最优先验GRN的选择因方法而异。

5. 评分算法的影响
以CollecTRI为先验GRN，比较decoupleR内置的12种TFA评分算法及Ucell，ULM的AUROC与Consensus相当，且显著优于或相当于其他多数算法。将pySCENIC默认的AUCell和metaTF默认的VIPER替换为ULM后，两者的AUROC均显著提升，说明ULM可有效泛化到不同GRN类型的TFA推断方法。

6. 扰动方式与TF DBD类别的影响
metaTF和pySCENIC对TF激活扰动的预测AUROC显著高于抑制扰动，decoupleR无此差异。细分扰动方式后，metaTF对CRISPRa的预测优于ORF过表达和CRISPRi；pySCENIC对CRISPRa和ORF过表达优于CRISPRi；decoupleR仍无显著差异。多元线性回归控制扰动方式后，TF DBD类别显著解释metaTF和pySCENIC的AUROC方差（metaTF校正R²=0.351；pySCENIC校正R²=0.526），但decoupleR不显著（校正R²=0.028）。其中，其他C4锌指类因子和色氨酸簇类因子的预测性能显著高于总体平均。

7. 计算效率与资源消耗分析
在单核限制下，decoupleR（ULM）运行时间最短；hdWGCNA、pySCENIC和scRegulate运行时间中等；PISCES、scMINER、TIGER、metaTF和decoupleR（Consensus）运行时间较长。峰值内存方面，decoupleR（ULM）和scRegulate较低，metaTF和TIGER较高。metaTF虽然预测性能最优，但其运行时间和峰值内存比pySCENIC高数十至数百倍；decoupleR中ULM与Consensus预测准确性相当，但ULM在速度和内存上优势明显。

**讨论与结论**

讨论指出，基于先验GRN的方法具有高置信度但缺乏细胞类型特异性，从头GRN方法具备数据特异性但缺乏独立实验验证，整合GRN方法有望融合两者优势。metaTF的消融实验证实，先验GRN和从头GRN对最优性能均不可或缺。pySCENIC作为广泛使用的方法，准确率较高但TF覆盖有限；decoupleR对数据特异因素稳健，且ULM可作为通用TFA评分算法提升其他方法。未来方法开发应重视整合GRN策略、先验GRN选择与通用评分算法设计。该研究局限性包括：测试TF仅占人类TF全谱的9.5%，数据集扰动类型不平衡，主要基于体外细胞系和单基因扰动，未涵盖多TF协同调控，且未纳入基础模型；未来需扩展至更广TF类型、复杂体内环境及新兴多组学数据。

结论方面，该研究建立了基于17个精心筛选的Perturb-seq数据集的实验验证基准，覆盖靶向135个独立TF的174次单基因扰动，为TFA推断提供了稳健、可扩展且可复现的评估框架。系统评估了基于先验GRN、从头GRN和整合GRN三类主流方法，发现使用整合GRN的metaTF在TF覆盖率及扰动细胞/TF预测准确性上总体最优；基于从头GRN的pySCENIC准确性仅次于metaTF但TF覆盖率较低；基于先验GRN的decoupleR在所有评估指标中也排名靠前。研究进一步证明，regulon在DEGs中的富集、先验GRN和评分算法的选择以及目标TF的扰动类型是推断准确性的关键决定因素，为TFA推断方法的选择和方法学发展提供了实用指导。