利用内源顺式与反式元件进行转录重编程，在 Komagataella phaffii 中以安全底物为来源高效表达食物蛋白

《Metabolic Engineering》：Transcriptional reprogramming with endogenous cis- and trans-elements for efficient food protein expression from safe substrates in Komagataella phaffii

　　

**识别内源顺式与反式元件以增强*K. phaffii*的表达 • 合理改造上游调控序列以降低启动子复杂性 • 对内源元件进行重编程以实现无甲醇高效表达 • 所得到的ESPRIT系统实现了食品蛋白的无甲醇生产**

**引言**

预计到2050年全球人口将接近100亿，这将使膳食蛋白需求增加30%–50%（Gu等人，2021；Van Dijk等人，2021）。基于畜牧业的传统蛋白生产路径难以完全满足人类不断增长的需求；因此，有必要探索其他可持续的蛋白质供应模式（Henchion等人，2017）。微生物重组表达和精准发酵被认为是生产可食用食品蛋白的关键技术路径。然而，高效、稳定且安全的底盘宿主和生产过程仍面临各种挑战（Knychala等人，2024）。

*Komagataella phaffii*（同义词：*Pichia pastoris*）是应用最广泛的重组蛋白生产真核平台之一。该菌株已获美国食品药品监督管理局（U.S. FDA）批准为"公认安全"（GRAS）菌株（Pe?a等人，2018；Schwarzhans等人，2017）。该酵母宿主具有真核生物翻译后修饰、异源蛋白高效分泌以及内源性分泌蛋白背景相对较低等优势（Ahmad等人，2014；Khlebodarova等人，2024；Tsuda和Nonaka，2024）。这些特性有利于重组蛋白的表达、分泌及下游纯化（Karbalaei等人，2020；Lv和Cai，2025）。此外，*K. phaffii*可在生物反应器中进行高密度培养，支持其工业化生产的潜力（Lv等人，2026）。然而，利用该宿主进行重组蛋白大规模发酵生产仍面临若干挑战。当前商业化的*K. phaffii*表达系统主要依赖传统的甲醇诱导型启动子*PAOX1*，该启动子活性被甲醇高度诱导，同时被其他碳源严格抑制（Zepeda等人，2018）。尽管甲醇是一种有前景的非食用底物，但其代谢特性对工艺控制和食品安全带来了重大挑战（Kuzman等人，2025；Zhang等人，2003）。与基于葡萄糖的培养相比，甲醇氧化需要更高的氧气供应并产生更多的热量，从而增加了大规模生物反应器对供氧和散热的需求（Curvers等人，2001；Liu等人，2016；Zhan等人，2016）。此外，甲醇的毒性和易燃性对大规模制造提出了额外的安全顾虑，培养液中的残余甲醇必须通过严格控制的下游纯化工艺彻底去除（?elik和?al?k，2012；Cereghino和Cregg，2000；Lv等人，2026）。随着生产规模的扩大，这些额外的工艺需求可能进一步推高生产成本，超出大宗可食用蛋白产品的经济可接受范围。因此，开发无甲醇的*K. phaffii*表达系统对于食品蛋白生产迫在眉睫。

近年来，已开发出替代内源启动子以实现利用葡萄糖、乙醇和阿拉伯糖等非甲醇底物进行蛋白生产，并采用了工程策略来提高启动子活性（Bernat-Camps等人，2023；Chen等人，2025；Ergün等人，2019；Flores-Villegas等人，2023；Gong等人，2026；Liang等人，2013；Liu等人，2016；Liu等人，2025b；Stadlmayr等人，2010）。然而，很少有启动子展现出超过*PAOX1*的表达能力。因此，大量工作致力于阐明*PAOX1*的转录调控并对其进行理性重新设计。已鉴定出若干参与*PAOX1*调控的关键转录因子，并对其中一些因子的结合位点和调控机制进行了表征（Lin-Cereghino等人，2006；Kranthi等人，2009，2010；Sahu等人，2014；Shi等人，2018；Wang等人，2016a，2016b；Wang等人，2017；Yang等人，2020）。在此基础上，转录因子工程已被应用于开发基于*PAOX1*的无甲醇表达系统。例如，有报道指出，敲除转录抑制因子Nrg1、Mig1和Mig2并过表达转录激活因子Mit1，或通过*PCAT1*驱动过表达Mit1或Mxr1，均可在非甲醇条件下激活*PAOX1*的表达（Vogl等人，2018；Wang等人，2017）。此外，针对*PAOX1*相关调控激酶和顺式调控DNA元件的工程策略也已被探索（Ergün等人，2020；Shen等人，2016）。尽管这些内源元件工程策略成功实现了解除抑制的*PAOX1*驱动表达，但现有方法仍局限于已知的部分调控组分。要实现高表达水平的无甲醇生产，仍需要进一步鉴定额外的调控元件并开发新的工程策略。

受合成生物学原理的启发，研究人员尝试重新构建天然表达元件以建立人工表达系统（Perez-Pinera等人，2016；Rantasalo等人，2018），类似策略也已被应用于在*K. phaffii*中开发无甲醇表达系统（Liu等人，2022；Tominaga等人，2024；Zhu等人，2022）。这些工具已实现了蛋白和天然产物的高效生产（Gong等人，2026；Liu等人，2019；Qian等人，2022；Wang等人，2025）。然而，这些系统通常依赖于外源调控模块。虽然可以获得高度的正交性和可编程性，但对于基因元件来源敏感的新型食品蛋白而言，这带来了额外的顾虑。外源元件增加了生产菌株的遗传复杂性，在产品开发过程中可能需要对遗传稳定性、非预期表达效应和食品安全性进行表征（欧洲食品安全局遗传修饰有机体专家组等，2022，2024；欧洲食品安全局科学委员会等，2022；欧洲食品安全局，2006）。因此，进一步探索和工程化*K. phaffii*中的内源调控资源是必要的。一种兼具高表达强度、无甲醇依赖和内源核苷酸序列组成的新型表达系统，可进一步拓展*K. phaffii*在食品蛋白生产中的潜在应用。

在本研究中，开发了一种内源精简型启动子-调控因子整合转录系统（ESPRIT），实现了*K. phaffii*中的高水平表达。通过挖掘内源启动子核心序列并将其与改造后的*PAOX1*上游调控序列组装，构建了一个强启动子P*AA13-t13*。在表达反式激活因子Mit1的条件下，该启动子在葡萄糖、甘油和乙醇等非甲醇碳源上表现出非常高的活性。此外，筛选了内源转录因子激活结构域（TFADs）并将其与Mit1的DNA结合结构域（Mit1BD）融合，生成了内源合成转录因子（sTFs）。所得到的ESPRIT系统实现了在葡萄糖上的正常细胞生长和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的优势表达，其表达量达到了甲醇上*PAOX1*驱动的6.8倍，以及葡萄糖上*PGAP*驱动的10.1倍。应用ESPRIT系统可在生物反应器中生产5.14 g/L β-乳球蛋白和1.95 g/L Brazzein，分别比*PAOX1*系统高出3倍和1.9倍，评估时仅使用单拷贝目标基因。

本研究拓展了*K. phaffii*的表达工具箱，并为构建无甲醇系统提供了改进的内源元件策略。所得到的ESPRIT系统兼具高表达强度、广泛的碳源兼容性和完全由内源元件组成的架构。这代表了用于安全可持续地生产可食用蛋白及其他大宗重组蛋白的有前景的表达平台。

**章节片段**

**质粒、菌株和培养条件**

本研究中使用的质粒和菌株列于表S1和S2中。酵母表达载体pPIC3.5k、pGAPZα以及*E. coli* Top10储存于本实验室。质粒pPlacO1cAG、pP-PA2G、pP-PA12G和pP-PA13G，以及*K. phaffii* Δku70（在*K. phaffii* GS115中敲除KU70）由本实验室构建并储存。大肠杆菌菌株在37°C的LLB培养基（1%[w/v]蛋白胨、0.5%[w/v]酵母提取物和0.5%[w/v] NaCl）中补充氨苄青霉素进行培养。

**转录组指导的内源启动子核心序列挖掘可改善启动子变体的活性**

启动子核心区域（也称为核心启动子）是参与转录起始的重要顺式调控元件，代表启动子活性的主要决定因素之一，其序列特征显著影响转录输出（Lubliner等人，2015；Liu等人，2020）。*K. phaffii*基因组包含对应于5000多个基因的核心启动子序列。为缩小筛选范围并提高鉴定到的概率……

**讨论**

开发高效、安全和可扩展的表达平台已成为生产新型食品蛋白的重要技术路线（Malila等人，2024；Nielsen等人，2024）。*K. phaffii*被认为是用于食品蛋白生产的重要真核微生物平台，可生产乳蛋白、血色素蛋白和甜味蛋白等（Deng等人，2023；Joseph等人，2019；Lv等人，2026；Yu等人，2023，2024）。目前，传统的*K. phaffii*

**CRediT作者贡献声明**

Jiayi Yang：调查研究。Yunhao Li：撰写—初稿、可视化、验证、方法论、调查研究、形式化分析、数据整理、概念构思。Qi Liu：方法论。Liufei Tao：调查研究。Menghao Cai：撰写—审阅与编辑、监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念构思。Yitao Zheng：项目管理

**未引用参考文献**

Ahn等人，2009；Albacar等人，2024；Casacuberta等人，2024；Mullins等人，2022；Efsa等人，2022；G Gupta等人，2021；Liu等人，2016。

**数据可用性**

数据可根据请求提供。

**资金来源**

本工作得到了国家自然科学基金（32671963）、国家重点研发计划（2022YFC2805102）和上海农业科技重点项目（K2025017）的支持。

**利益冲突声明**

M.C.、Y.L.、J.Y.和L.T.已提交了一项关于ESPRIT系统的中国专利。作者声明无其他利益冲突。

**致谢**

英文润色由Editage（www.editage.cn）母语人士完成。

Yunhao Li | Jiayi Yang | Liufei Tao | Qi Liu | Yitao Zheng | Menghao Cai