《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Pressured heating and enzymatic digestion effects on lupine allergenicity
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羽扇豆因其高含量的蛋白质、脂肪和不可溶性纤维，以及其技术功能特性和对人体健康的有益作用，正越来越多地被用作人类食品中的配料和添加剂。由于近几十年来羽扇豆过敏患病率不断上升，其在欧盟和澳大利亚已被列入致敏食品清单。本研究聚焦于探究加热处理（包括有压和无压条件
羽扇豆因其高含量的蛋白质、脂肪和不可溶性纤维，以及其技术功能特性和对人体健康的有益作用，正越来越多地被用作人类食品中的配料和添加剂。由于近几十年来羽扇豆过敏患病率不断上升，其在欧盟和澳大利亚已被列入致敏食品清单。本研究聚焦于探究加热处理（包括有压和无压条件）联合酶解对羽扇豆过敏原性的影响，并通过体外（Western blot）和体内（皮肤点刺试验，SPT）检测进行分析。本研究发现表明，加压加热处理（高压灭菌和可控瞬时降压技术，DIC）后联合蛋白酶E5酶解可大幅降低羽扇豆的过敏原性。DIC处理后联合酶解是降低羽扇豆过敏反应性的最优组合，但建议采用更大样本量的血清进行验证。
**论文解读**
**一、研究背景与现存问题**
食物过敏已成为一个重要的公共健康问题，其在成人中的患病率估计约为5%，在儿童中约为8%。羽扇豆（Lupinus spp.）属于豆科（Leguminoseae）蝶形花亚科（Faboideae），因其富含蛋白质、脂类及矿物质而具有较高的营养价值，但同时豆类也是由免疫球蛋白E（IgE，即过敏反应中的核心效应分子）介导的过敏反应的重要诱因。豆类过敏原主要为种子贮藏蛋白，包括cupin超家族中的11S豆球蛋白（legumins）和7S豌豆球蛋白（vicilins），以及醇溶蛋白超家族中的2S白蛋白（albumins）。此外，脂质转移蛋白（LTPs）、profilins和第10类病程相关蛋白（PR-10）等泛过敏原（panallergens）也常见于豆类中。
近年来，羽扇豆在人类食品中的应用日益广泛，然而羽扇豆过敏的患病率也呈上升趋势，自2007年起已被列入欧盟致敏食品清单。羽扇豆过敏患者与花生之间存在高度交叉反应性，且羽扇豆诱导的严重过敏反应（anaphylaxis）似乎比花生诱导的更频繁。世界卫生组织/国际免疫学会联合会（WHO/IUIS）已正式认定的羽扇豆过敏原包括：L. angustifolius中的Lup an 1（7S豌豆球蛋白）和Lup an 3（LTP），以及L. albus中的Lup a 5（profilin）。此外，L. albus中还存在两个已被部分鉴定的主要过敏原：Lup 1（7S蛋白，34.5 kDa）和Lup 2（11S蛋白，20 kDa），其与花生、大豆、豌豆和小扁豆过敏原的高同源性可解释羽扇豆与这些豆类之间的高度交叉反应性。
尽管食品加工（包括热加工和非热加工）常被用于改善食品的营养特性、感官品质和安全性，并能改变蛋白质的结构，影响其体外消化率和过敏原性，但目前关于食品加工和消化率对羽扇豆蛋白过敏原性影响的研究信息仍然有限。早期研究提示，煮沸对羽扇豆蛋白影响不大，但高压灭菌（138°C、30分钟）可大幅降低IgE结合能力，同时也检测到一种70 kDa的新生过敏原（neoallergen）。DIC技术结合了热量和蒸汽压力，已被报道可降低食品过敏原性。蛋白酶也被认为是降低豆类和坚果食品过敏原性的有力工具，加压加热联合酶解对降低nsLTP的IgE结合能力尤为有效。
**二、研究内容与意义**
基于上述背景，研究人员系统研究了在有超声辅助的条件下，加压加热联合酶解对羽扇豆过敏原性的影响。研究通过蛋白SDS-PAGE电泳、IgE和IgG免疫印迹（Western blot）以及过敏患者皮肤点刺试验（SPT），从体外和体内两个维度全面评估了不同处理组合的效果。研究发现，DIC处理后联合酶解是降低羽扇豆过敏反应性的最优组合。该研究为开发低致敏性羽扇豆蛋白产品提供了重要的概念验证（proof-of-concept），对于为过敏人群提供营养支持具有重要的应用前景和产业转化价值。
**三、关键技术方法概述**
本研究的关键技术方法包括：（1）羽扇豆样品的不同热处理：煮沸（100°C、60分钟）、高压灭菌（138°C、256 kPa、30分钟）以及可控瞬时降压技术DIC（170°C、700 kPa、120秒）；（2）酶解处理：从E3和E5两种Amano食品级蛋白酶中筛选出E5蛋白酶，对羽扇豆全籽糊状物在超声浴（55°C）条件下进行酶解；（3）蛋白表征：采用SDS-PAGE电泳分析蛋白谱；（4）过敏原检测：使用特异性IgG抗体（抗11S、抗2S、抗LTP）进行Western blot，使用患者血清进行IgE免疫印迹；（5）体内过敏原性评估：对6名过敏患者（5名花生过敏、1名羽扇豆过敏，均来自马德里Fundación Jiménez Diaz医院过敏科门诊）进行皮肤点刺试验；另使用两组血清池（10名贮藏蛋白致敏者Sprot和17名LTP致敏者）进行IgE免疫印迹分析。
**四、研究结果**
**4.1 酶对羽扇豆蛋白的消化效率**：在E3和E5两种酶中，E5（Amano Protin SD–AY10）对羽扇豆蛋白的水解效率最高。不同时间点（1、2、3、19小时）的水解产物相似，故后续实验选择酶解1小时。
**4.2 加工羽扇豆样品的电泳表征**：煮沸羽扇豆的蛋白谱与生羽扇豆相似，呈现10至50 kDa分子量范围的多个条带。加压加热处理（高压灭菌AU和DIC）后，蛋白条带呈现弥散状（smearing），提示蛋白发生碎裂。生羽扇豆和煮沸羽扇豆经E5酶解后出现高度蛋白降解，25 kDa以上条带消失。AU和DIC处理后经E5酶解的样品表现出最大程度的降解。
**4.3 使用特异性IgG抗体检测羽扇豆过敏原的Western blot分析**：抗11S抗体在生羽扇豆中识别到约100 kDa的两条带，煮沸和DIC处理后该识别消失，但高压灭菌样品中仍可检测到两条带。抗2S白蛋白抗体在生羽扇豆和煮沸样品中检测到50 kDa处的强条带，高压灭菌和DIC处理后该条带不再被识别。抗LTP抗体在生羽扇豆和煮沸样品中检测到50、25和10 kDa三条带，高压灭菌样品中无识别，DIC处理样品中仅见10 kDa处的一条弱带。
**4.4 处理对患者SPT的影响**：6名患者对生羽扇豆均呈阳性皮肤反应（风团平均值10.0±1.6 mm）。5名患者对煮沸样品呈阳性反应（风团平均值5.3 mm），但与对照无显著差异。高压灭菌和DIC处理后，风团值显著降低（P<0.05）：仅2/6患者对高压灭菌羽扇豆呈阳性（风团平均值2.6 mm），3/6患者对DIC处理羽扇豆呈阳性（风团平均值3.3 mm）。
**4.5 IgE免疫印迹分析**：生羽扇豆对照组在100至10 kDa范围内检测到广泛的IgE结合蛋白。高压灭菌和DIC处理后，IgE结合量大幅减少。经E5酶解后，仅有对照+E5样品在20 kDa以下可见少量反应条带；高压灭菌+E5和DIC+E5组合样品中未检测到任何IgE反应条带。光密度定量分析证实，煮沸、高压灭菌和DIC均使IgE结合量显著降低（P<0.05），酶解后进一步显著降低。在Sprot血清池中，生羽扇豆和煮沸样品在60、50、25和12 kDa处有类似反应条带，AU和DIC样品条带明显减少。在LTP血清池中，生羽扇豆在50、30、25和12 kDa处反应性较高，煮沸后条带强度降低，AU和DIC处理样品未见清晰反应条带。
**五、讨论与结论**
本研究结果证实，加压加热（高压灭菌和DIC）联合酶解处理可有效降低羽扇豆的过敏原性。热和压力处理可引起蛋白质二级结构改变（变性或降解），进而影响其消化率、生物利用度和过敏原性。高压灭菌和DIC可能诱导相似的蛋白结构变化——解析叠、碎裂及聚集，破坏构象表位，增加酶的可及性，从而增强酶解效率。DIC处理相比高压灭菌更具优势，原因在于其产生的瞬时自蒸发效应和更短的处理时间。
在结论中，研究人员指出：本研究发现构成了一项概念验证，表明加压加热（高压灭菌和DIC）后联合蛋白酶E5酶解可大幅降低羽扇豆的过敏原性。DIC处理后联合酶解是降低羽扇豆过敏反应性的最优组合，尽管这些发现仍需通过更大规模和更多样化的血清样本进行验证。
