合成功能微生物群驱动发酵番茄酸汤微生态演替与品质提升

《Food Chemistry: X》：Microecological succession and quality enhancement of fermented tomato sour soup by synthetic functional microbiota

　　

番茄酸汤（tomato sour soup）是中国贵州省黔东南苗族侗族自治州的一种传统发酵食品，通过番茄辅以红辣椒、生姜、糯米等原料厌氧发酵制成。传统自然发酵依赖环境微生物，易导致产品质量不稳定。本研究构建了三种功能性合成微生物群（synthetic microbial consortia）对番茄酸汤进行强化发酵：SG组接种酵母菌群（yeast consortium），EG组接种Eurotium菌群（Eurotium consortium，含曲霉属真菌），MG组同时接种两种菌群，以未接种的UG组为对照。研究人员系统监测了发酵过程中pH、总酸、氨基酸态氮（amino acid nitrogen）、亚硝酸盐（nitrite）等理化指标，总酚含量（total phenolic content, TPC）、总黄酮含量（total flavonoid content, TFC）及DPPH/ABTS自由基清除率等抗氧化指标，并利用高通量测序（high-throughput sequencing）和基于UPLC-MS/MS的非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）分析了微生物群落演替和代谢物谱变化。结果表明，Eurotium菌群的接种显著增强了酸化效率和亚硝酸盐降解能力，重塑了微生物群落结构和代谢功能，并特异性激活了苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）和黄酮类生物合成（flavonoid biosynthesis）通路。Eurotium促进了黄酮类化合物的生物转化，使其生成抗氧化活性更强的衍生物，如槲皮素（quercetin）和咖啡酸乙酯（ethyl caffeate）。本研究为Eurotium介导的番茄酸汤发酵提供了观察性证据，并为发酵菌剂选择提供了参考。

合成功能微生物群驱动发酵番茄酸汤微生态演替与品质提升

番茄酸汤（tomato sour soup）是源自中国贵州黔东南地区的传统发酵调味品，由番茄、红辣椒、生姜和糯米等原料经厌氧发酵（anaerobic fermentation）制成。传统生产工艺依赖环境微生物的自然发酵，导致产品批次间质量波动大、风味一致性难以控制，这成为制约其工业化生产的关键瓶颈。近年来，接种特定发酵剂以定向调控发酵过程成为研究热点，已有研究表明接种布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）、布氏慢乳杆菌（Lentilactobacillus buchneri）和乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）等乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）可缩短发酵周期并提升风味品质。然而，现有研究多聚焦于乳酸菌和酵母菌，对其他功能性微生物群的关注十分有限。Eurotium属（散囊菌属）真菌是一类广泛存在于传统发酵食品体系中的耐酸微生物，具有强大的代谢可塑性——Eurotium cristatum（冠突散囊菌）在固态发酵中可使游离多酚含量提高近5倍，在液态发酵中可降低涩味并增强抗氧化活性，还能通过苯丙氨酸代谢途径生成花香型香气化合物。据此，研究人员推测Eurotium有望成为番茄酸汤发酵的新型功能性发酵剂，并开展了本研究。

研究人员从中国传统发酵产品（广西六堡茶和贵州仁怀酱香型白酒高温大曲）中分离鉴定出Eurotium amstelodami Q4和Eurotium cristatum G12组成Eurotium菌群，以及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W1、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）Y4、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）Y2和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Z1组成酵母菌群。以0.5%（w/w）总接种量设置四个实验组：未接种的自然发酵对照组（UG组）、接种Eurotium菌群的EG组、接种酵母菌群的SG组、以及同时接种两种菌群（各0.25%）的MG组。发酵在24°C条件下持续18天，分别在第1、3、5、7、9、12、15和18天监测理化参数，在第1、3、9和18天采集样本进行抗氧化活性、微生物多样性和代谢物分析。核心技术方法包括：采用Illumina NextSeq 2000平台进行细菌16S rRNA V5-V7区和真菌ITS1-ITS2区的高通量测序以解析微生物群落组成与演替规律；采用Thermo Fisher UHPLC-Orbitrap Exploris 240质谱系统进行非靶向代谢组学分析以揭示代谢物全景图谱；以及利用多元统计分析（PLS-DA、OPLS-DA）和KEGG通路富集分析整合多维数据集。

在发酵过程理化特性变化方面，研究发现EG组在发酵终点表现出最高的总酸含量（21.10 ± 0.18 g/kg），同时亚硝酸盐峰值浓度显著低于UG组，并在整个发酵期内维持最低水平，表明Eurotium菌群对亚硝酸盐积累具有最显著的抑制效果。氨基酸态氮含量在发酵初期各组均下降，但在中后期EG和MG组出现回升，这与Eurotium的蛋白水解活性有关，可能有利于提升产品的鲜味品质。总酚含量和总黄酮含量在发酵过程中持续增加，发酵终点时EG组的TPC（75.41 ± 1.75 mg/g）和TFC（29.41 ± 0.26 mg/g）均显著高于UG组。DPPH和ABTS自由基清除率在三个接种组中均显著高于UG组（P < 0.05），表明功能性菌群接种有效提升了产品的抗氧化活性。

在微生物群落组成与演替方面，真菌群落中，UG组和EG组最终均以Kazachstania属（哈萨克斯坦酵母属）为绝对优势属，SG组以Saccharomyces（酵母属）占主导（相对丰度持续高于70%），MG组则以Wickerhamomyces（威克汉姆酵母属）为优势属（相对丰度超过50%）。值得注意的是，MG组中Wickerhamomyces的丰度高于SG组，表明Eurotium的引入间接影响了酵母群落结构。Aspergillus（曲霉属，代表接种的Eurotium）在EG和MG组发酵初期丰度较高，第9天后降至1%以下，显示Eurotium主要在发酵早中期发挥核心功能。细菌群落方面，所有组别最终均以LAB为主导，Lentilactobacillus（慢乳杆菌属）为核心属，在EG组第18天达到72.27%的相对丰度。Weissella（魏斯氏菌属）作为典型的过渡属在发酵前期富集，而Pantoea（泛菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属）等条件致病菌在发酵启动后迅速消失，表明该发酵体系具有可靠的微生物安全性。LEfSe分析鉴定出5个真菌属和10个细菌属在组间存在显著差异（LDA > 3.5, P < 0.05）。

在微生物共现网络方面，基于Spearman相关分析（|r| > 0.7, P < 0.05）构建的共现网络揭示了各组独特的微生物互作模式。UG组保留了原生微生物平衡状态；SG组呈现以Saccharomyces和Wickerhamomyces为中心的酵母-细菌互作网络；EG和MG组接种的Aspergillus（Eurotium）驱动群落向高度模块化结构演进。MG组中观察到的Aspergillus与Secundilactobacillus（第二乳杆菌属）的强正相关可能介导了含氮化合物分解和有机酸合成，而Levilactobacillus（轻乳杆菌属）与Debaryomyces和Saccharomycopsis的多重正相关则暗示存在促进生物活性化合物积累的互惠共生关系。

在代谢物动态图谱方面，非靶向代谢组学共鉴定出4118种代谢物，其中2687种在HMDB数据库中获得注释，1139种映射到326条KEGG通路。PLS-DA分析显示各组代谢轮廓在第3天即出现明显分离（R = 0.9638, P = 0.001）。OPLS-DA筛选差异代谢物显示，MG组相对于UG组在各发酵阶段均呈现出最多的差异代谢物数量。KEGG富集分析揭示核黄素代谢和胆汁分泌是所有处理组共同富集的通路，而苯丙烷生物合成、黄酮类生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等通路在EG和MG组特异性富集，表明Eurotium对次生代谢途径具有独特的激活效应。

在差异代谢物分析方面，有机酸及其衍生物超类中共鉴定出281种差异代谢物，羧酸及其衍生物为主要亚类。苦味肽Gly-Phe在发酵后期显著下调，而具有浓厚味（kokumi）和鲜味的二肽Ile-Leu在接种组显著上调，反映了功能性微生物群对蛋白质降解途径的差异化调控。苯丙烷和聚酮化合物超类中共鉴定出201种差异代谢物，黄酮类化合物为最丰富的亚类。EG和MG组中chrysoeriol（金圣草黄素）、kaempferol（山奈酚）和luteolin（木犀草素）在全部四个发酵阶段持续上调，而UG和SG组中这些代谢物下调，这与通路富集分析结果高度吻合。同时，chalconaringenin（查尔酮柚皮素）和vitamin P（维生素P，即rutin/芦丁）在接种组发酵前期上调，而它们的下游转化产物phloretin（根皮素）、quercetin（槲皮素）和ethyl caffeate（咖啡酸乙酯）在发酵中后期积累，并与抗氧化指标呈显著正相关，表明功能性微生物群系统性地推动了多酚类化合物的逐级生物转化。

在微生物-代谢物-抗氧化活性关联分析方面，Aspergillus与luteolin、chrysoeriol、kaempferol和chalconaringenin等黄酮苷元呈显著正相关，Lactiplantibacillus（植物乳杆菌属）、Lentilactobacillus和Kazachstania与quercetin、phloretin和ethyl caffeate呈正相关，但与vitamin P呈负相关，提示存在一个以Eurotium起始黄酮糖苷脱糖基化、LAB和酵母继续修饰释放的苷元的接力式生物转化过程，共同贡献于产品的抗氧化活性提升。

综上所述，本研究通过构建含酵母和Eurotium spp.的功能性合成微生物群接种番茄酸汤发酵体系，全面阐释了人工接种对发酵过程的定向调控效应。研究结论指出，接种功能性微生物群显著增强了酸化效率、亚硝酸盐降解能力和氨基酸态氮转化水平，同时重塑了微生物群落结构和代谢功能，促进了生物活性成分的合成，因此靶向接种功能性微生物群是优化发酵工艺、提升产品品质和安全性的有效策略。未来工作将利用动物模型进一步评估强化发酵番茄酸汤的生理效应，包括其对肠道微生物群、氧化应激和脂质代谢的影响。本研究为构建功能明确的微生物群以及通过微生物群落调控提升番茄酸汤营养品质提供了理论基础和数据支持。