《Food Control》：Targeting
Bacillus cereus Biofilms: Biocontrol Strategies, Mechanisms of Action, and Emerging Challenges
Bacillus cereus是一种普遍存在的产芽孢病原菌，由于其能够在非生物表面快速定殖并形成高度耐受的生物膜，对食品工业构成持续挑战。这些生物膜充当芽孢的储库，并可能促进毒力决定因子（包括肠毒素和高度稳定的催吐毒素cereulide）的持久存在与表达。随着食品工业寻求传统卫生程序和化学消毒剂的更可持续替代方案，新的生物防治策略正受到越来越多的关注。本综述仔细考察了天然来源及仿生化合物在预防和根除B. cereus生物膜方面的有效性，包括精油、植物和微生物来源的提取物、噬菌体、噬菌体衍生内溶素（endolysins）、工程化合物以及创新的抗生物膜表面。研究人员评估了其生理和分子机制，特别是膜破坏和群体感应干扰（quorum sensing interference），重点关注参与生物膜发育和毒力的关键调控基因的转录调节。此外，本文还讨论了当前文献中的主要方法学局限性，包括广泛使用单菌株模型和非工业相关材料（如聚苯乙烯（polystyrene）），而非食品级不锈钢表面。最后，研究人员强调了未来研究的关键前景，指出有效的生物防治策略必须超越营养细胞根除，靶向生物膜相关芽孢，并减少B. cereus和cereulide在食品加工环境中的持久性。
**1. 引言（Introduction）**
Bacillus cereus sensu lato（s.l.）是由7个系统发育群组成的产芽孢细菌类群，包括炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）以及蜡状芽孢杆菌sensu stricto（s.s.）。在食品领域，B. cereus s.s.既是主要腐败菌，又是能产生多种毒力因子的食源性病原体，包括三种肠毒素（Nhe、Hbl和CytK）以及导致呕吐综合征的cereulide。2024年欧盟监测数据显示，该类毒素事件造成127起暴发、3315例病例和创纪录的9例死亡。B. cereus s.l.广泛分布于环境，凭借其代谢灵活性、生物膜形成能力和高抗性芽孢而持续存在。生物膜既可形成于气液界面、浸没条件，也可形成漂浮的浮膜类型。芽孢使其在干旱、极端温度或pH以及抗菌剂暴露下长期存活。该菌群中生物膜形成、运动性和芽孢形成的调控网络相互关联，涉及Spo0A、SinR/SinI、σB、σH等多种调节因子。生物膜使B. cereus能在橡胶、聚丙烯、塑料、玻璃、不锈钢乃至食品表面快速定殖，成熟生物膜内含有大量芽孢，可释放并污染食源性产品。生物膜与毒素表达的联系日益受到关注：cereulide可在不锈钢表面生物膜中早期产生，并可能作为自诱导物参与群体感应（quorum sensing，QS）；SinR/SinI系统可能调控肠毒素基因；生物膜内不同亚群（毒力细胞、坏死营养细胞、芽孢形成细胞等）呈现生理异质性。本综述聚焦源于生物（而非化学）的防治策略，旨在整合B. cereus生物膜防控的多种途径及其作用机制。
**2. 针对B. cereus生物膜的生物防治策略（Biocontrol Strategies against B. cereus Biofilms）**
在讨论天然来源的生物防治剂前，需注意酶处理已被广泛研究，如蛋白酶、多糖降解酶和DNase等。本节重点介绍源自植物、真菌、细菌和病毒的生物化合物。
**2.1 精油（Essential oils）**
多种精油具有杀灭B. cereus芽孢的活性，例如小豆蔻、杜松叶和茶树油可使芽孢减少约3个对数单位。精油中的主要单一成分无法完全复制全油的杀孢效果，提示次要成分或协同作用的重要性。柠檬草精油可直接在米饭中减少芽孢并抑制营养细胞。柠檬醛（柠檬草精油主要成分）通过破坏营养细胞膜和芽孢包被结构发挥杀菌及抑制萌发作用，在1/2最低抑菌浓度（MIC）下即可破坏玻璃表面的生物膜。山鸡椒精油（含柠檬醛>50%）可下调鞭毛基因（fla、fliY）和生物膜相关基因（codY、sinR、sinI、plcR、cwpFM），降低eDNA浓度，并通过结合AI-2信号相关蛋白干扰QS，同时延长猪肉在室温下的保质期。丁香、牛至、黄樟和肉桂精油能延长B. cereus的迟滞期或抑制芽孢萌发，从而预防生物膜形成。柏树精油的主要成分δ-3-蒈烯通过破坏细胞膜发挥作用。茶树油中的(+)-松油烯-4-醇可增加扩散性信号因子（DSF）和二酮哌嗪水平，抑制EPS合成和群集运动。百里醌、二烯丙基二硫等也已证实具有抗生物膜活性。香茅和杜松精油可显著减少浮游芽孢，香茅油还能减少附着在不锈钢表面的芽孢。精油成分受植物来源、提取方法和环境因素影响，如百里香酚含量变异较大。百里香酚和香芹酚通过消散跨膜pH梯度和抑制ATP合成破坏细胞膜，香芹酚纳米乳剂在牛奶中可完全杀灭B. cereus并减少肠毒素产生。纳米乳化和壳聚糖包封可增强精油活性。精油与其他天然产物组合（如橙油与戊糖乳杆菌滤液）可协同下调spo0A、calY并上调sinR，有效减少工业表面上的生物膜。
**2.2 植物提取物及其化合物（Plant extracts and their compounds）**
众多植物提取物显示出抗B. cereus生物膜活性，例如咖啡果皮提取物抑制生物膜形成并清除成熟生物膜；石榴皮提取物清除效果优于200 ppm氯；苹果醋下调tasA、sipW和plcR；车前草提取物通过下调purD、purH和lrgB等基因发挥作用。下文按化学家族细分。
**2.2.1 酚类化合物和多酚（Phenolic compounds and Polyphenols）**
多种黄酮类化合物（如杨梅苷、桑皮素、异甘草素）通过破坏细胞膜和下调关键基因抑制生物膜。迷迭香酸抑制生长和生物膜形成，降低EPS浓度，下调鞭毛基因及毒力因子表达。阿魏酸和水杨酸可增加混合生物膜对后续处理的脆弱性。藤黄酮D、姜黄素等也表现出抗生物膜或抗QS活性。富含酚类的提取物（如香椿提取物）通过影响嘌呤/组氨酸生物合成及鞭毛运动来抑制生物膜。
**2.2.2 萜类化合物和皂苷（Terpenoids and Saponins）**
山茶皂苷降低B. cereus的代谢活性、聚集能力和生物膜形成，改变spo0A、plcR、comER、rpoN、nprR表达，并减少AI-2产生，在不锈钢、陶瓷和玻璃表面可将生物膜细胞减少约1个对数单位。人参皂苷Rh2通过改变质膜抑制生物膜形成。α-古巴烯通过降低细菌表面疏水性抑制生物膜，并可在牛肉汤等复杂食品模型中抑制生长。
**2.2.3 苯丙素类、香豆素和醌类（Phenylpropanoids, Coumarins, and Quinones）**
肉桂醛（肉桂精油主要成分）破坏细胞壁完整性，抑制群集运动可达90%，减少肠毒素生成，并在牛奶模型中有效控制污染。特定萘醌和香豆素衍生物在低至0.01 μg/mL时即可抑制和破坏预成生物膜。
**2.2.4 生物碱（Alkaloids）**
从南天竹中分离的原小檗碱型生物碱(?)-四氢小檗红碱醋酸酯（THBA）能预防生物膜形成，并通过改变膜完整性破坏玻璃表面的预成生物膜。
**2.2.5 有机硫化合物（Organosulfur Compounds）**
从辣木籽中提取的RBITC在MIC（0.14 mg/mL）下可抑制B. cereus生物膜形成达77.25%，一小时内破坏指数生长期细胞的膜完整性，并在山羊奶储存中有效减少菌量。大蒜等香辛料提取物富含有机硫，可破坏生物膜、直接作用于浮游芽孢并降低生物膜内芽孢的耐热性。
**2.2.6 有机酸和无机盐（Organic Acids and Inorganic Salts）**
苹果酸、柠檬酸以及铜盐、铁盐等可抑制PVC和玻璃表面的生物膜形成，通过阻断早期黏附、完全抑制EPS产生和群集运动。7%柠檬酸与200 ppm NaClO联合处理10分钟可使不锈钢表面72小时生物膜减少6.9 log CFU/cm2，并在清洗系统中使生物膜细胞不可检测。
**2.3 细菌和真菌化合物（Bacterial and fungal compounds）**
乳酸菌及其衍生物（如细菌素、EPS）是重要来源。戊糖乳杆菌产生的pentocin通过下调LuxS/LsrB介导的QS通路和KinB/KinC/Spo0B双组分系统，抑制生物膜形成和芽孢形成。海洋细菌产生的耐盐脂肪酶（如Oceanobacillus sp. PUMB02）可破坏90–95%的预成生物膜。解淀粉芽孢杆菌分泌的脂肽6-2能分散B. cereus和铜绿假单胞菌的成熟生物膜。假单胞菌产生的鼠李糖脂部分清除生物膜。真菌来源的demethylincisterol A3可下调comER、plcR、tasA、rpoN、sinR等基因，抑制生物膜形成、运动性及肠毒素表达。绿脓菌素、紫色杆菌素、灵菌红素等微生物色素也显示出不同程度的抑制和清除作用。
**2.4 噬菌体及其衍生酶（Bacteriophages and their Derived Enzymes）**
环境噬菌体可有效抑制B. cereus生物膜，但效果取决于生物膜发育阶段。污水来源的噬菌体PBC_MG88和PBC_MG99能破坏产生呕吐毒素菌株的48小时生物膜达50.1%；湖泊分离的噬菌体BC-VP可破坏49%预成生物膜。噬菌体vB_BceM-DC1和vB_BceM-DC2在牛奶中联用效果更佳。然而，噬菌体需要营养细胞复制、宿主谱窄、存在基因转移风险。内溶素（endolysins）作为替代方案，可裂解肽聚糖中高度保守的键，不易产生抗性。内溶素PlyB13S在聚苯乙烯微孔板上表现出更明显的抗生物膜活性。细菌自溶素Lys14579可在2小时内破坏24小时生物膜，并将芽孢萌发率降低至45%。部分内溶素具有芽孢结合域（SBD），如Ply57、LysPW2和LysPW4，能够抑制芽孢萌发和繁殖。PlyG的SBD主要位于酶活性域内，可特异性结合芽孢外孢子层。将内溶素与萌发剂联用可裂解新萌发的细胞。
**2.5 抗生物膜表面工程策略（Antibiofilm Surface Engineering Strategies）**
镍-聚四氟乙烯（Ni-PTFE）抗粘附涂层可降低表面能，使B. cereus附着减少近2 log CFU/cm2。超疏水表面（由石蜡或氟化蜡晶体自组装形成）可在7天内抑制生物膜形成达99.9%。蝉翼表面的纳米柱通过物理机制使附着细胞变形和裂解，从而阻止生物膜形成。
**2.6 仿生和工程化合物（Bioinspired and engineered compounds）**
绿色合成纳米颗粒（如银、氧化锌）利用植物或微生物代谢物作为还原剂和稳定剂，可抑制生物膜形成。二氧化钛纳米颗粒可破坏EPS基质、诱导氧化应激并穿透细胞，从而瓦解预成生物膜。合成抗菌肽（AMP）衍生物具有双倍效力，破坏质膜并可能结合基因组DNA，同时抑制芽孢萌发。含冰片基的2(5H)-呋喃酮衍生物可在64 μg/mL下使预成生物膜内活菌减少超过3个对数单位。苯醌衍生物AA-861和parthenolide通过干扰TasA聚合为淀粉样纤维来预防生物膜。使用虚拟筛选发现了Sortase A抑制剂（如氨苄西林、依那普利）和PelA抑制剂（SK-017154-O），均可抑制生物膜形成。聚-D-甘露糖可抑制生物膜形成。合成PapR7肽类似物作为PlcR竞争性拮抗剂，可阻断毒力调控通路。AI-2前体衍生物通过干扰QS抑制生物膜。机器学习筛选出的合成肽XWC26能在10分钟内杀灭B. cereus，显著抑制芽孢萌发，并在米饭中将菌群减少约2个对数单位。
**3. 生物化合物：局限、空白和展望（Biocompounds: Limits, Gaps and Perspectives on B. cereus Biofilms）**
**3.1 当前工业应用和实施挑战（Current industrial applications and challenges for implementation）**
尽管实验室研究显示多种生物防治策略具有潜力，但工业应用仍有限。食品加工环境中的生物膜控制仍以传统清洁和消毒为主。噬菌体产品商业化仅限少数食源性病原体，针对B. cereus生物膜的防治尚未开发。天然化合物需在复杂食品基质、混合物种生物膜、化合物稳定性、感官影响、法规审批和生产成本等方面进一步验证。
**3.2 限制转化实验空白（Experimental gaps limiting the translation of antibiofilm strategies）**
多数植物提取物研究在聚苯乙烯（PS）而非食品级不锈钢表面进行，不符合工业实际。许多研究仅评估24小时形成的早期生物膜，而B. cereus ATCC 10987在48小时才达到最大总菌数。处理时间过长可能导致生物膜自然分散。植物提取物成分的天然化学变异性需考虑。多数研究使用单一菌株，忽视了菌株多样性。对生物膜内芽孢比例随时间的增加以及混合物种生物膜的评估也常被忽略。
**3.3 改进生物防治化合物的递送和应用（Improving the delivery and application of biocontrol compounds）**
活性包装（如壳聚糖膜掺入精油）可控制释放抗菌和抗氧化化合物，延长食品保质期。纳米乳液技术可提高生物化合物的稳定性、分散性和在复杂食品基质中的控制释放能力。
**3.4 靶向毒素产生和毒力（Targeting toxin production and virulence）**
即使生物膜被清除，cereulide仍可持久存在并污染食品。目前尚无天然化合物能降解cereulide。多数研究仅关注肠毒素基因表达，忽略cereulide合成基因簇ces。生物膜中肠毒素表达动态研究较少。多种生物防治化合物可下调plcR及下游肠毒素基因，提示其具有抗毒力潜力。
**3.5 评估适应性和抗性发展（Assessing adaptation and resistance development）**
需进行长期重复暴露试验以评估潜在抗性。B. cereus IFR-NL94-25在亚致死香芹酚暴露后产生耐受性，其机制涉及膜流动性降低和脂质组成改变。EOs的抗性发展尚未在B. cereus中报道，但其他食源性病原体可对茶树油和百里香精油产生适应。噬菌体抗性已知，内溶素尚未见自然抗性报道。某些抗生素在亚抑菌浓度下反而促进生物膜形成，因此需确定最佳处理浓度。
**3.6 处理生物膜相关芽孢（Addressing biofilm-associated spores）**
成熟生物膜中高达90%的细胞可能形成芽孢。若芽孢未被消除，可残留于处理表面并引发再污染。有效的控制策略必须同时具备抗营养细胞和抗芽孢活性。
**4. 结论（Conclusion）**
天然来源的生物防治策略在控制B. cereus生物膜方面显示出潜力，但食品工业应用仍面临挑战。关键问题包括：精油或植物提取物能否持续应用于食品加工环境以预防生物膜形成？此类预防性应用需严格评估安全性、长期成本效益和感官影响。另一个重要议题是：工业界应优先采用预防性生物防治策略，还是集中研发根除已形成生物膜的清洁方法？靶向生物膜相关芽孢并减轻cereulide持久性，是将这些仿生策略转化为大规模工业应用的必要条件。
