《Food Chemistry》：Discovery and validation of pumpkin seed protein-derived bioactive peptides targeting α-glucosidase: Insights into the molecular mechanisms
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摘要南瓜籽蛋白（PSP）是一种有前景的生物活性肽前体，但其水解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性机制尚未完全阐明。本研究通过模拟胃肠消化和计算机筛选，从PSP中获得了一种此前未报道的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的四肽YYPW。动力学实验表明，YYPW是一种强效混合型抑制剂（IC50
摘要
南瓜籽蛋白（PSP）是一种有前景的生物活性肽前体，但其水解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性机制尚未完全阐明。本研究通过模拟胃肠消化和计算机筛选，从PSP中获得了一种此前未报道的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的四肽YYPW。动力学实验表明，YYPW是一种强效混合型抑制剂（IC50 = 279.61 μmol/L）。分子对接揭示，YYPW通过π–π堆积和氢键作用与催化对（Asp443/Asp542）及周围芳香族残基均发生相互作用。后续分子动力学模拟表明，这种双位点结合诱导结构紧缩并降低关键催化环的构象柔性。多光谱分析（紫外-可见光谱、荧光光谱和圆二色谱）证实了微环境极性的改变以及从α-螺旋向β-折叠的转变。这些发现有助于阐明YYPW的抑制机制，并突显了其在血糖控制应用中的进一步开发潜力。
引言
糖尿病是一种以持续性高血糖为特征的慢性代谢性疾病，仍是全球主要的健康关注问题（Genitsaridi等，2026）。在2型糖尿病（T2DM）中，反复的餐后血糖升高导致血糖控制不佳并增加心脏代谢风险（Kamruzzaman等，2021）。膳食淀粉最初由唾液和胰腺α-淀粉酶水解，生成的寡糖和二糖随后被位于肠微绒毛膜上的α-葡萄糖苷酶转化为可被吸收的葡萄糖。抑制这一末端消化步骤可以减缓葡萄糖的释放和吸收，从而降低碳水化合物摄入后血糖的快速升高（Hossain等，2020）。调节碳水化合物消化的重要性还得到近期证据的支持，即食物多糖的结构变化可以改变淀粉的可消化性（Fu等，2026）。
临床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖，能有效降低餐后血糖波动，但长期使用常引起胃肠道不适，如腹胀和腹泻（Hossain等，2020；Nong & Hsu，2021）。这一局限性促使人们寻找天然来源的抑制剂。来自天然来源的多糖、多酚和肽均显示出血糖调节潜力。例如，黄芪（Astragalus membranaceus）中的一种水溶性多糖在体外抑制了α-葡萄糖苷酶，并改善了T2DM小鼠的葡萄糖代谢（Chen等，2022）。一些天然存在的α-葡萄糖苷酶抑制剂可能还具有延缓碳水化合物消化以外的代谢效应。在细胞模型中，1-脱氧野尻霉素通过激活AMPK促进米色脂肪细胞重塑（A.-N. Li等，2019）。在天然候选物中，食品来源的肽因其可获得性、生物相容性、序列多样性和潜在的结构修饰可能性而备受关注。含有芳香族或疏水氨基酸（包括酪氨酸、色氨酸和脯氨酸）的低分子量肽通常与α-葡萄糖苷酶抑制作用相关，因为这些残基可以促进与酶疏水区和芳香区之间的相互作用（Ibrahim等，2018；Lu等，2023）。
种子和种子加工副产品是功能化合物的可持续来源。从辣木（Moringa oleifera）种子中分离出的氰苷在实验模型中通过代谢重编程减轻了糖尿病肾病，展示了种子来源成分的生物活性潜力（Ge等，2026）。南瓜（Cucurbita属）也因其潜在的血糖调节作用而被研究。南瓜籽通常在南瓜和南瓜籽油加工过程中产生，是植物蛋白的丰富来源（Fatima等，2025；Xie等，2025）。南瓜籽蛋白（PSP）具有相对均衡的氨基酸组成，含有芳香族氨基酸（包括苯丙氨酸和酪氨酸）以及疏水残基（如亮氨酸、缬氨酸和脯氨酸）（Vinayashree & Vasu，2021）。这种组成表明，PSP在胃肠消化过程中可能释放出含有芳香族和疏水残基的短肽。此前关于南瓜降血糖特性的研究主要集中在多糖、黄酮类化合物和D-手性肌醇上（Adams等，2014；Batool等，2022；Wu等，2021），而对PSP衍生肽的研究主要涉及血管紧张素转化酶和二肽基肽酶-IV的抑制作用（Chen, Zhang等，2025；Li等，2024）。因此，PSP作为α-葡萄糖苷酶抑制肽来源的潜力仍未得到充分探索。
生物活性指导的分级分离，包括尺寸排阻色谱和反相HPLC，已在生物活性肽组分的富集中得到广泛应用（Jiang等，2018）。然而，反复的分离和活性测定使该过程十分繁琐，且测定到的活性无法直接归因于特定序列。LC-MS/MS分析随后可能鉴定出大量肽段，使得对所有候选肽进行合成和实验测试不切实际。计算筛选可以通过根据预测的生物活性、理化性质、毒性和致敏性风险以及潜在的酶结合相互作用对肽段进行优先级排序，从而补充活性指导的分级分离，在合成和实验验证之前进行筛选（Du等，2023）。将结构和生物学证据相结合以进行候选物优先级排序的有效性也在其他生物活性化合物类别的系统评价中得到了验证，包括s-三嗪衍生物（Dai等，2023）。
本研究结合模拟胃肠消化、活性指导的分级分离、LC-MS/MS鉴定和计算筛选，从PSP中鉴定α-葡萄糖苷酶抑制肽。优先候选肽被合成并进行体外评估。活性最强的合成肽YYPW通过酶动力学、分子对接、分子动力学模拟、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和圆二色谱进行了进一步研究。本研究旨在鉴定一种此前未报道的PSP衍生的α-葡萄糖苷酶抑制肽，并表征其与酶的相互作用。
章节摘要
材料与试剂
南瓜（Cucurbita moschata Duch.）种子采购自中国重庆当地。酵母α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）和对硝基酚-α-D-葡萄糖苷（pNPG）分别由锐基生物技术和源叶生物技术提供。阿卡波糖购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。猪胰酶和胃黏膜胃蛋白酶分别购自阿拉丁生物化学和赢心实验室设备有限公司（中国上海）。除非另有说明
PSP胃肠消化产物对α-葡萄糖苷酶的抑制
通过将南瓜籽蛋白（PSP）进行体外消化（采用INFOGEST方案，Brodkorb等，2019）来评估其释放肽的生物活性潜力。胃消化后α-葡萄糖苷酶抑制率为48.64 ± 1.76%，肠消化后增至55.97 ± 2.45%（P < 0.05；图1），提高了7.33个百分点。尽管增加具有统计学意义，但其幅度较为温和。进一步的蛋白水解
结论
采用一种结合模拟胃肠消化、活性指导的分级分离、LC-MS/MS鉴定、计算筛选和实验验证的综合策略，从南瓜籽蛋白中鉴定α-葡萄糖苷酶抑制肽。在合成的候选肽中，YYPW显示出最强的抑制活性，IC??值为279.61 μM，并表现出混合型抑制。分子对接和分子动力学模拟表明，YYPW与……发生相互作用
CRediT作者贡献声明
王明谦：撰写—初稿，调查，正式分析，数据整理。刘霞：方法，数据整理。俞泽远：方法，数据整理。冉佳：方法，数据整理。陈福建：调查，正式分析。李杨：调查，正式分析。余晓东：资源，资金获取。何祺一：撰写—审阅与编辑，监督，概念化。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报道的工作。
致谢
本工作由重庆林业改革与发展基金（项目编号 Yu-lin-ke-tui-2019-2）和重庆师范大学基金项目（项目编号 19XLB006）提供资金支持。
王明谦|刘霞|俞泽远|冉佳|陈福建|李杨|余晓东|何祺一
