《Food Hydrocolloids》：Ligand-based intelligent modification of β-lactoglobulin: multi-target virtual screening, interaction mechanism elucidation, and functional validation
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•通过深度学习建模与验证建立了一种智能化修饰方法。•多靶点虚拟筛选方法探索了β-乳球蛋白（β-LG）的新型酚酸配体。•通过构象变化和结合位点掩蔽阐明了抗原性降低机制。•体外消化前后复合物的抗氧化能力均显著提升。引言在可持续食品体系的推动下，现代食品工业正积极寻找合成乳化剂和人
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通过深度学习建模与验证建立了一种智能化修饰方法。
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多靶点虚拟筛选方法探索了β-乳球蛋白（β-LG）的新型酚酸配体。
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通过构象变化和结合位点掩蔽阐明了抗原性降低机制。
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体外消化前后复合物的抗氧化能力均显著提升。
引言
在可持续食品体系的推动下，现代食品工业正积极寻找合成乳化剂和人工抗氧化剂的天然替代品，以满足消费者对少加工、无添加产品日益增长的需求（Anjali等，2024）。牛β-乳球蛋白（β-LG）是乳清中的主要球蛋白，因其可作为天然载体的能力，在制备此类多功能食品中引起了广泛关注。在结构上，β-LG属于脂质运载蛋白家族，由162个氨基酸残基折叠而成，形成八链反平行β桶状结构，构成能够结合配体的中心疏水腔（Saxena等，2019）。三维（3D）β-LG构型如图1A所示。这种独特的两亲性结构赋予β-LG卓越的内在物理特性，使其能够充当多功能天然乳化剂、起泡剂以及疏水性生物活性物质的稳健纳米载体。然而，天然β-LG在工业中的广泛应用受到两个固有缺陷的严重限制：它缺乏内源性抗氧化能力，并且表现出显著的抗原性，是牛奶蛋白过敏的主要抗原（Xu等，2019）。为了克服这些局限，又不采用剧烈的、可能损害标签的化学反应修饰，β-LG与天然植物源性酚酸的自发且可逆非共价复合作用已被认为是一种极具前景的重构策略。这种非破坏性的物理结合本身就提供了一种安全且环保的途径来升级乳蛋白。
酚酸是一类天然生物活性物质，广泛分布于植物源性食品中，主要由带有酚羟基的苯甲酸或肉桂酸衍生物组成。近年来，由于其显著的抗氧化、抗炎和抗菌等多功能性（Kumar & Goel，2019），这些化合物受到了研究人员的高度关注，在食品加工和保健品开发中展现出巨大的应用潜力。当酚酸被引入β-LG中时，它们可以通过特定的共价或非共价物理化学键合诱导蛋白质构象重排。这种配体驱动的结构演变可能能够遮蔽β-LG表面介导过敏反应的结构域，同时通过酚酸高效的抗氧化基团赋予复合物前所未有的抗氧化特性。β-LG与阿魏酸（10:6）的共价修饰产生了具有显著增强抗氧化能力的偶联物，DPPH和ABTS自由基清除率分别达到65.06%和88.22%，同时β-LG抗原性显著降低（约35%）（Xue等，2023）。
此前的研究已探讨了酚酸与β-LG之间的相互作用。Liu等（2023）报道，双咖啡酰奎宁酸总体上与β-LG的结合力比单咖啡酰奎宁酸更强，并增强了其抗氧化能力。Chanphai和Tajmir-Riahi（2021）鉴定了β-LG上没食子酸的结合位点并观察到蛋白质构象变化，而Schild等（2023）在其实验条件下未发现没食子酸与天然β-LG之间相互作用的明确证据。综上所述，这些发现表明β-LG-酚酸相互作用取决于酚酸结构和实验条件。然而，它们对β-LG抗原性的影响仍未得到充分理解。目前一些研究依赖传统的分子对接。然而，食品体系具有高度动态性，分子对接提供的是基于构象的经验得分，可能无法完全捕捉所有潜在的残基-配体相互作用。因此，许多具有潜在高生物活性的化合物仍未被筛选出来。在本研究中，我们使用分子对接筛选了与β-LG具有高结合亲和力和多个结合位点的酚酸，并鉴定它们的相互作用位点，然后应用我们此前开发的基于深度学习的模型预测酚酸与其他位点的结合概率。我们同时获得了由黄酮类与β-LG及酚酸与β-LG制备的复合物对比结果，本研究重点探讨酚酸的影响。基于对接性能和参考文献相关性，选择了四种酚酸：没食子酰葡萄糖（PG）、3,4-二咖啡酰奎宁酸（DCQ）、绿原酸（CCA）和没食子酸（GA）。随后使用此前开发的深度学习模型进行互补的残基级相互作用预测。通过模型预测，这四种化合物被发现具有多个潜在的β-LG结合位点。通过分子对接和计算模型确定的相对较多的预测潜在结合位点可能表明，酚酸与β-LG相互作用具有更大的潜力，从而调节β-LG的结构和抗原性。随后，我们采用多光谱技术从构象变化的角度评估了β-LG-酚酸复合物的结构变化。我们还评估了制备的复合物的抗原性，以及同一复合物在模拟胃肠消化前后的抗氧化特性。通过结合基于对接的筛选与互补的深度学习预测，本研究为β-LG-酚酸非共价复合物的靶向设计和功能调控提供了一种可行策略。
章节摘要
分子对接
通过CB-DOCK2进行分子对接以预测β-LG的配体结合位点（Liu等，2022）。β-LG受体结构（PDB ID：3NPO）和配体坐标从蛋白质数据库和PubChem中获取。模拟后，选择最有利的对接构象进行分析。使用PyMOL（版本3.1.6.1）进行三维可视化，使用LigPlot（版本2.2.9）展示二维（2D）相互作用模式。筛选工作流程见图
分子对接分析
我们从多酚数据库（
http://phenol-explorer.eu/）中选择了27种酚酸，并与β-LG进行分子对接。基于vina得分、预测结合位点和商业可得性，我们最终筛选出四种酚酸：PG、DCQ、CCA和GA（图1B）。按vina得分排序，PG、DCQ和CCA因其相对有利的vina得分和预测相互作用位点而被优先考虑（表S1）。车前子苷和燕麦酰胺2p被
结论
在本研究中，通过分子对接选择了β-LG结合配体，随后使用此前开发的深度学习模型进行互补的残基级预测。从最初的27种化合物中，基于对接性能和对比分析价值，选择了四种酚酸（PG、DCQ、CCA和GA）。随后的深度学习分析提供了互补的残基级预测，显示多个β-LG残基具有高相互作用概率
CRediT作者贡献声明
陈露瑶：软件。陈建瑞：监督、软件。尚一哲：软件。赵梦娜：验证、数据整理。舒国伟：监督、资源、项目管理。Jens Brockmeyer：监督。丁亚丹：验证。辛洋：写作——审阅与编辑、写作——初稿、验证。陈丽：写作——审阅与编辑、写作——初稿、监督、概念化
利益冲突声明
? 作者声明，不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作由亚历山大·冯·洪堡基金会资深研究员奖学金（编号3.5-CHN-1240032-HFST-E）、国家自然科学基金委员会（32572721）、陕西省重点研发计划（2025CY-JJQ-209）和西安市科技项目（2025JH-NJSYB-0005）资助。我们感谢马凯提供分子动力学模拟技术支持。
辛洋|Jens Brockmeyer|丁亚丹|赵梦娜|舒国伟|尚一哲|陈露瑶|陈建瑞|陈丽
