超快速冷却与猪肉宰后嫩化过程中RyR1-DHPR相互作用的变化及Ca2+释放有关

《Food Research International》：Very fast chilling is associated with altered RyR1-DHPR interaction and Ca2+ release during postmortem pork tenderization

　　

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  VFC激活RyR1门控，放大Ca²⁺释放和猪肉嫩化。
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  VFC增强了RyR1-DHPR相互作用，15°C是关键转折点。
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  静电相互作用和氢键是驱动RyR1-DHPR偶联的主要力量。
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  RyR1_Arg 1073/Arg 1076和DHPR_Asp 665/Asn 800介导温度响应。

引言

嫩度被认为是决定鲜猪肉消费者接受度和经济价值的最关键品质属性之一。骨骼肌细胞中的钙紊乱是驱动肌肉死后转变为肉的关键生化事件。肌浆网是主要的钙池，屠宰后其蓄钙能力逐渐减弱，伴随Ca²⁺向肌浆泄漏（Ha & Bekhit, 2024）。这种再分配和肌浆Ca²⁺的升高调节了肉嫩化过程。虽然死后僵直开始初期游离Ca²⁺的初始激增可导致肌节缩短和肉变硬（Pomponio & Ertbjerg, 2012），但Ca²⁺的持续增加最终通过激活蛋白水解途径改善肉的嫩度（Bhat et al., 2018）。值得注意的是，环境温度可能改变Ca²⁺释放的总体模式（Jaime et al., 1992）。通道蛋白释放Ca²⁺的功能不仅取决于其丰度，还取决于其门控状态。瑞诺定受体1（RyR1）作为关键钙释放通道，在闭合构象时会将Ca²⁺锁定在肌浆网内（Gong et al., 2021）。与传统的0–4°C冷藏相比，超快冷却（VFC）在死后5小时内迅速将肌肉温度降至接近冰点。先前的研究发现，在死后2.7小时VFC冷却至1°C可在死后僵直之前诱导肌浆网Ca²⁺的大量释放，显著促进猪肉嫩化（Xiao et al., 2024）。虽然这种冷却效果已显示可能与维持高RyR1表达有关（Xiao et al., 2026），但RyR1表达仅反映了这一过程的方面之一，并未提供VFC如何调节通道开放和Ca²⁺释放的详细信息。因此，VFC处理对该通道门控状态的精确分子机制仍不清楚。

RyR1形成同源四聚体结构，并在骨骼肌的兴奋-收缩偶联中发挥关键作用（Gong et al., 2021）。在此过程中，RyR1的开放状态由横小管（T小管）膜上的二氢吡啶受体（DHPR）调节，从而影响Ca²⁺释放（Xu et al., 2024）。具体而言，DHPR II-III环与RyR1 SPRY2结构域之间的物理偶联触发了通道开放（Tae et al., 2009），这些蛋白质之间的相互作用对温度变化高度敏感。Andronache等人（2009）证明，肌浆钙的温度依赖性变化可能由RyR1-DHPR相互作用介导。冷应激能够破坏肌浆网的功能（Kanda et al., 1977）。Sitsapesan等人（1991）观察到，将离体羊RyR通道从23°C冷却至5°C会延长平均开放时间，从而增加其开放概率。基于这些死后早期温度和钙释放的变化，我们推测急性降温可能触发DHPR和RyR1之间的机械偶联或构象变化，从而使通道进入高开放概率状态。

利用RyR1通道状态的特定调节剂可能是阐明这一复杂调控机制的有效策略。咖啡因是RyR1的经典激活剂，可增加通道对Ca²⁺的敏感性并促进开放（Murayama et al., 2015）。相反，作为通道抑制剂的四卡因能有效将RyR1锁定在闭合状态，从而阻止Ca²⁺释放（Laver & van Helden, 2011）。此外，骨骼肌蛋白质之间的相互作用通常通过免疫沉淀和免疫荧光等生化方法进行表征。分子对接和分子动力学模拟等技术已成为分析外部环境（包括温度和压力）对蛋白质构象演化和动态结合细节影响的另一个强大工具（Hu et al., 2024）。因此，将生物方法与分子模拟相结合，将为分析死后冷却过程中RyR1-DHPR复合物的温度响应提供综合视角。

因此，本研究的目的是阐明VFC调节肉类RyR1门控和Ca²⁺释放的嫩化机制。使用激活剂咖啡因和抑制剂四卡因调节RyR1差异性开放状态，构建了猪肌肉体外孵育模型。每个模型均接受VFC处理，并分析钙变化及肉质结构。此外，利用免疫荧光共定位和分子动力学模拟可视化和验证VFC诱导的DHPR与RyR1之间的相互作用。

章节摘要

肌肉采样与处理

从北京二商肉食集团有限公司随机选取6头杜洛克×长白×大约克杂交猪胴体（平均体重83.56 kg，6月龄）。屠宰后30分钟内立即从每个胴体上切取左侧背最长肌肌肉，并采集40 g作为死后1小时样本。剩余肌肉被分成30块胴体（每块约6 g），并随机均等地接受三种

结果

载剂组、激活组和抑制组肉类的核心温度在死后约2.7小时降至1°C，平均整体冷却速率为13°C/h。

VFC诱导的RyR1激活增强肌节破裂和肉的嫩度

肌节缩短通常被认为增加肉的硬度。然而，我们的研究发现，VFC诱导的RyR1激活导致肌节过度收缩和结构破裂，最终改善了猪肉嫩度。与肌节长度相关的质量特性可能需要完整的肌节排列在剪切过程中提供均匀的阻力（Marsh & Leet, 1966）。肌节缩短至极端程度会导致粗丝刺穿或被

结论

VFC处理（平均冷却速率13°C/h）与猪肌肉中RyR1的门开启相关。同时，VFC处理部分减轻了抑制剂诱导的闭合。这可能归因于VFC处理可在死后早期维持RyR1与DHPR的相互作用。随后钙通道的开放可导致Ca²⁺从肌浆网向肌浆的大量释放。这种肌浆中过量的Ca²⁺将触发

作者贡献声明

肖志远：写作–审阅与编辑，写作–初稿撰写，调查研究，数据整理。白玉强：写作–审阅与编辑。王小路：概念构思。闵成军：资源提供。李少波：方法论。刘珊珊：项目管理，资金获取。张德权：写作–审阅与编辑，监督指导。李欣：验证，软件。侯承利：写作–审阅与编辑，项目管理。

未引用参考文献

des Georges et al., 2016

利益冲突声明

作者声明他们不存在可能影响本文所报告工作的已知财务利益竞争或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（32272397）的财政支持以及中国农业科学院畜牧研究所中央实验室提供的激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）技术援助。

肖志远|白玉强|王小路|闵成军|李少波|刘珊珊|张德权|李欣|侯承利