## 结构相似、聚集迥异：精确发酵与牛奶来源β-乳球蛋白（BLG）多尺度比较及N端EAEA延伸的作用

《Food Research International》：β-lactoglobulin from precision fermentation and milk exhibit similar protein structure but distinct aggregation behaviour: a multi-length-scale perspective

　　

来自精确发酵与牛奶的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin, BLG）呈现出相似的蛋白质结构，却表现出不同的聚集行为：一个多尺度的视角。

- 发酵来源与牛奶来源的β-乳球蛋白（BLG）显示出等价的高级结构（higher-order structure）。
- 发酵来源的BLG含有N端（N-terminus）EAEA延伸的蛋白质形式（proteoforms）。
- 该N端修饰增加了蛋白质的表面电荷。
- 发酵来源的BLG在加热时表现出降低的聚集倾向。
- 分子动力学模拟（molecular dynamics simulations）表明，朝向外侧的阴离子N端会阻碍聚集的发生。

## 论文解读文章

### 一、研究背景与科学问题

乳清蛋白是乳品加工中的重要副产物，约占牛奶总蛋白的20%，其中β-乳球蛋白（β-lactoglobulin, BLG）是含量最丰富的组分，约含18 kDa、162个氨基酸残基，具有5个半胱氨酸残基，其中Cys121以游离巯基形式存在。BLG营养价值突出，其必需氨基酸、支链氨基酸和亮氨酸含量显著高于一般膳食蛋白质。然而，乳制品加工中不可避免的热处理会引起BLG变性并进一步聚集，这一过程分为两个阶段：首先蛋白质在变性温度下解折叠，随后通过疏水相互作用、静电相互作用以及巯基/二硫键（SH/SS）交换反应发生分子间聚集，从而影响溶解度、起泡性和乳化性等功能性质。牛BLG存在至少11种遗传变异体，其中A和B变异体最常见；不同变异体在75°C下的聚集速率及140°C下的热凝固时间相近，但在高浓度下的凝胶行为存在差异。近年来，精确发酵（precision fermentation）技术使重组BLG的生产成为可能，并可在序列中引入微小变异以改善分泌效率或定制功能。然而，发酵体系中信号肽的不完全加工常导致N端出现“EAEA”（谷氨酰-丙氨酰-谷氨酰-丙氨酰）四肽延伸，这类蛋白质形式（proteoforms）对蛋白质结构与热聚集行为的影响尚不清楚。因此，研究人员开展本研究，旨在从多尺度水平系统比较含EAEA延伸的发酵来源BLG（f-BLG）与牛奶来源BLG（m-BLG）的结构等价性，并阐明N端修饰对热诱导聚集和凝固行为的影响机制。

### 二、研究手段与技术方法

本研究的样品来源为：f-BLG由Vivici公司提供（Vivitein? BLG）；m-BLG购自Sigma Aldrich；用于变异体比较的BLG A、B及AB变异体从牛奶中纯化获得。主要技术方法包括：完整蛋白液相色谱-质谱联用（intact LC-MS）用于蛋白质形式鉴定；肽图分析（peptide mapping）用于一级结构确认；二维核磁共振氢碳相关谱（2D ¹H-¹³C HSQC）用于高级结构指纹比较；体积排阻色谱-紫外-多角度光散射（SEC-UV-MALS）用于寡聚状态分析；毛细管等电聚焦（cIEF）用于等电点测定；超滤/渗滤（UFDF）用于统一离子强度；热凝固时间（HCT）与热致浑浊时间（HOT）测定用于评估140°C下的热稳定性；超高效液相色谱-紫外检测（UPLC-UV）用于定量加热后残余天然BLG；电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）用于矿物质组成分析；ζ电位（zeta potential）测量用于表面电荷表征；流变学黏度测量结合Krieger-Dougherty模型用于估算蛋白有效体积分数；全原子分子动力学模拟（MD，GROMACS/Amber ff12SB力场）在20°C和75°C下模拟蛋白质结构及热诱导初期分子接触事件。

### 三、研究结果

#### 3.1 牛奶来源与发酵来源β-乳球蛋白的结构等价性

##### 3.1.1 完整蛋白质谱

通过完整蛋白LC-MS分析，m-BLG以成熟序列形式为主（92%），另有钠加合物和双己糖糖化形式；f-BLG中79%为成熟序列加EAEA四肽延伸形式，约10%为未鉴定的+42 Da形式，其余为少量EA-BLG、焦谷氨酸化EAEA-BLG等形式。结果显示f-BLG的主要蛋白质形式确为N端EAEA延伸。

##### 3.1.2 肽图分析

胰蛋白酶消化后的肽图显示，f-BLG与m-BLG的色谱峰基本一致，仅在N端肽段区域存在差异；f-BLG的序列覆盖率为87%（高置信度），包括中等置信度后可达100%。这一结果证实两者的一级结构仅在N端存在差异。

##### 3.1.3 核磁共振波谱