《PLOS One》：Computational screening of oncogenic genetic variations in tumor suppressor proteins driving gastric cancer pathogenesis
编辑推荐：
胃癌（Gastric cancer, GC）目前是全球第五大常见癌症，通常由肿瘤抑制通路失调驱动。虽然针对蛋白质遗传变异的单项研究较为普遍，但针对调控GC通路、同时表现出表达失调和高突变频率的蛋白质进行系统层面的综合分析仍属空白。因此，本研究旨在识别关键基因及
胃癌（Gastric cancer, GC）目前是全球第五大常见癌症，通常由肿瘤抑制通路失调驱动。虽然针对蛋白质遗传变异的单项研究较为普遍，但针对调控GC通路、同时表现出表达失调和高突变频率的蛋白质进行系统层面的综合分析仍属空白。因此，本研究旨在识别关键基因及其致病性变异，这些变异破坏了GC通路的肿瘤抑制能力。研究人员采用基于深度学习的图神经网络模型，识别在GC中同时表现出表达失调和高突变倾向的基因。对关键肿瘤抑制蛋白（TP53、CDH1和APC）及其遗传变异和分子组分进行了深入的计算分析，包括进化保守性分析、生物物理能量评估以及用于构象变化检测的无监督机器学习。变异体通过cBioPortal数据库和患者生存数据进行了验证。研究人员的深度学习模型表现出卓越的性能（MSE：0.00482±0.00023至0.07108±0.00437；R2：0.85098±0.01903至0.85899±0.01987；AUC-ROC：0.93095±0.01758至0.93309±0.00725），并鉴定出1,886个同时具有差异表达和突变倾向的基因。图神经网络分析显示TP53是最显著的核心基因（突变频率47.6%），其次是ERBB2（8.8%）、CDH1（8.2%）和APC（6.8%）。来自cBioPortal的变异体验证确认了36个严重影响翻译后修饰（甲基化和磷酸化）位点的错义SNP以及60个无义SNP与GC的关联。此外，TP53、CDH1和APC在GC组织中显著上调，并与患者生存期的改变相关（p<0.05）。转录因子EZH2和miRNA miR-129-5p被确定为影响所有三种肿瘤抑制因子的关键调控元件。此外，突变触发了多种常见致癌基因的失调，包括CCNE1/2和FGFR2。这项系统层面分析提供了一个分子框架，展示了致病性变异如何从根本上损害GC通路中的肿瘤抑制蛋白，从而为GC干预确定了潜在的生物标志物和精准治疗决策。
**胃癌肿瘤抑制蛋白致病性遗传变异的计算筛选：研究背景、方法、结果与意义**
**一、研究背景与问题提出**
胃癌（Gastric cancer, GC）是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因。尽管近年来许多国家的发病率和死亡率有所下降，GC仍然是严重威胁人类健康的重大疾病。GC的发生发展涉及多条关键信号通路的失调，包括受体酪氨酸激酶（RTKs）及其下游的MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路、p53通路、Wnt/β-catenin通路、NF-κB和TGF-β通路等。肿瘤抑制蛋白作为基因组的守护者，调控细胞周期、凋亡和DNA损伤修复等关键细胞过程。TP53、CDH1和APC等肿瘤抑制基因的遗传变异与GC通路密切相关，并在GC患者中广泛报道。
然而，既往研究存在以下不足：第一，大多数研究聚焦于单个肿瘤抑制蛋白的错义SNP效应，缺乏在系统水平上同时识别GC中高度失调且具有高突变频率的关键蛋白的综合分析；第二，多数既往研究仅关注单一类型的致病性变异，尚未对影响GC通路肿瘤抑制能力平衡的所有临床显著致病性遗传变异进行系统鉴定和验证；第三，对于致病性变异如何通过分子干扰（包括转录因子、miRNA、甲基化、磷酸化、泛素化位点等）影响肿瘤抑制蛋白功能的机制尚不清楚。因此，本研究旨在通过系统层面的综合分析，揭示GC通路中关键肿瘤抑制蛋白的致病性遗传变异及其分子机制。
**二、研究内容与主要发现**
研究人员开发了一种基于深度学习的图神经网络（Graph Neural Network, GNN）优先级排序模型，整合差异表达基因、突变倾向基因、蛋白质-蛋白质相互作用网络及GC通路特异性基因，系统识别GC发病中的关键基因。研究鉴定了1,886个同时具有差异表达和突变倾向的基因，其中TP53以47.6%的突变频率成为最显著的核心基因，其次是ERBB2（8.8%）、CDH1（8.2%）和APC（6.8%）。进一步分析聚焦于三种关键肿瘤抑制蛋白TP53、CDH1和APC，通过多层面的计算分析揭示致病性遗传变异对肿瘤抑制功能的破坏机制。研究最终验证了36个与GC直接相关的错义SNP和60个无义SNP，并揭示了EZH2转录因子和miR-129-5p作为同时调控三种肿瘤抑制蛋白的关键分子元件。此外，研究发现这些突变触发多种致癌基因（CCNE1/2、FGFR2、TERT等）的表达失调，为理解GC发病机制和开发精准治疗策略提供了新视角。
**三、主要关键技术方法**
本研究采用了多层级的计算分析框架。首先，利用GEPIA2数据库获取RNAseq基因表达数据，cBioPortal数据库获取GC特异性突变倾向基因，通过Venn图鉴定共同基因，并从STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，KEGG数据库获取GC通路特异性基因。其次，开发了基于图卷积网络（GCNConv）的深度学习模型，采用两层GCNConv层、ReLU激活函数和dropout正则化（rate=0.3），通过嵌套5折交叉验证评估模型性能。随后，从ClinVar数据库检索临床显著致病性变异，运用PolyPhen2、SIFT、SNPs&GO等七个预测工具鉴定有害错义SNP，使用I-Mutant 2.0和MUPro评估蛋白质结构稳定性变化，通过Missense3D和HOPE服务器分析蛋白质三维结构效应，ConSurf服务器进行进化保守性分析，UCSF Chimera和Swiss-Pdb Viewer进行能量计算和最小化分析，GPS-MSP 1.0、GPS-6.0和GPS-Uber预测翻译后修饰位点。样本队列来源包括cBioPortal数据库中147例GC患者样本用于初始突变频率分析，以及5,623例GC患者样本（来自22项研究）用于变异验证。最后，采用Schrodinger's Biologics Package进行滴定曲线和能量模式分析，利用k-means聚类算法进行原子水平无监督机器学习分析，通过GEPIA2和Kaplan-Meier plot分析蛋白质表达与患者生存的关联，NetworkAnalyst 3.0构建基因调控网络。
**四、主要研究结果**
**4.1 最显著失调突变倾向基因的鉴定**
通过图神经网络模型，研究人员在训练、验证和测试数据集中获得了优异的预测性能，MSE低至0.00482±0.00023至0.07108±0.00437，R2为0.85098±0.01903至0.85899±0.01987，AUC-ROC达到0.93095±0.01758至0.93309±0.00725。研究鉴定出10,981个突变倾向基因和3,741个差异表达基因，其中1,886个基因（占DEGs的50.4%）同时具有两种特征。网络分析显示TP53具有最高的度中心性（0.239）、介数中心性（0.081）和紧密中心性（0.521），确立其作为GC进展核心基因的关键地位。
**4.2 GC通路的肿瘤抑制蛋白**
KEGG通路分析显示，TP53、APC和CDH1通过三种不同机制发挥肿瘤抑制作用。APC和CDH1均抑制β-catenin，阻止癌细胞不受控制的增殖；TP53则在DNA损伤时被激活，抑制不受控制的增殖、提高存活率并减轻基因组不稳定性。
**4.3 蛋白质肿瘤抑制结构域定位**
结构域定位分析揭示了三个蛋白质的关键功能区域：TP53的肿瘤抑制结构域位于氨基酸109-288位，APC位于127-207位，CDH1位于155-262位。
**4.4 临床变异检索与有害错义SNP鉴定**
从ClinVar数据库共鉴定出216个TP53、19个APC和22个CDH1的临床显著错义SNP。通过七个计算工具的一致性评估，54个TP53、9个APC和11个CDH1错义SNP被归类为“高风险”变异。
**4.5 蛋白质结构稳定性与三维结构效应**
稳定性分析显示，TP53的全部54个、APC的9个以及CDH1的7个高风险错义SNP显著降低蛋白质结构稳定性。三维结构分析鉴定了TP53中的54处、APC中的三处和CDH1中的两处结构损伤，表明这些SNP导致显著的蛋白质构象改变。
**4.6 进化保守性与能量分析**
ConSurf分析显示，TP53的54个SNP位点保守性评分为7-9，APC R141S和CDH1 D254Y评分为9，表明这些位点在进化上高度保守，变异可能对蛋白质功能产生深远影响。能量分析揭示突变蛋白质相对于野生型存在显著结构不稳定性，其中TP53的多个突变位点（如D281A、R273P等）表现出特别高的能量最小化值。
**4.7 翻译后修饰位点预测**
GPS-MSP 1.0预测TP53中有9个甲基化位点、APC中有一个甲基化位点；GPS-6.0预测TP53中有4个磷酸化位点。特别的，位于甲基化位点的错义SNP（K132R、K132N、R175G、R175L、R196P）和磷酸化位点的错义SNP（T125R、T125K、S240R、S240G）可能破坏肿瘤抑制蛋白的翻译后修饰调控。
**4.8 cBioPortal变异验证**
通过cBioPortal数据库对5,623例GC患者样本（22项研究）的验证，确认了TP53基因中的35个错义SNP和CDH1基因中的1个错义SNP与GC直接相关。此外，还验证了60个与GC发病机制相关的无义SNP。
**4.9 能量模式比较**
滴定曲线分析显示，TP53 T125R突变体（pI=8.9）与野生型（pI=8.6）相比等电点略升高，CDH1 D254Y突变体维持相同pI（4.3），APC R141S突变体的pI从5.5降至5.3。疏水性分析揭示了突变导致的局部疏水特性改变，能量分布分析显示CDH1 D254Y突变体在178-183位残基附近出现显著的能量峰（-391.263至+711.939 kcal/mol），表明该区域可能存在静电排斥。
**4.10 无监督机器学习原子水平分析**
k-means聚类分析揭示了突变特异性构象变化。TP53 T125R突变扰乱了前三个聚类组的原子关联，CDH1 D254Y和APC R141S突变分别破坏了聚类组3和聚类组4。TP53和APC有13个关键氨基酸受影响，CDH1则涉及50个氨基酸的原子内容改变。
**4.11 蛋白质表达与患者生存关联**
表达分析显示，TP53、CDH1和APC在GC组织中均显著上调（FDR校正p值分别为3.6e-08、7e-05和0.0081）。生存分析表明，TP53（HR=1.68）、CDH1（HR=1.43）高表达与较差的患者生存显著相关，而APC（HR=0.78）高表达则与较好的生存相关。此外，三种基因的风险比均随癌症分期进展而逐渐增加。
**4.12 蛋白质网络与癌症标志**
STRING分析揭示了CSNK1A1作为TP53和APC的共同相互作用蛋白，CTNNA1连接APC和CDH1。癌症标志富集分析显示三种蛋白参与维持增殖信号、逃避生长抑制、基因组不稳定、抵抗细胞死亡、组织侵袭和转移以及肿瘤促进性炎症等多个癌症标志。
**4.13 基因调控网络**
调控网络分析鉴定出EZH2作为TP53、APC和CDH1的共同转录因子，hsa-miR-129-5p作为三种蛋白的共同miRNA。此外，HMGA1、DNMT1、HDAC1、STAT3、SIRT1、ESR1、NFKB1、RELA等转录因子同时调控TP53和CDH1。
**4.14 致癌基因表达改变**
突变对致癌基因表达的影响分析显示，TP53突变导致CCNE1（log2FC: 0.44）和TERT（log2FC: 0.49）显著上调；APC突变导致CCNE1、CCNE2、ERBB2、FGFR2和TERT表达上调；CDH1突变主要导致FGFR2（log2FC: 0.15）表达上调。
**五、讨论与结论**
本研究的讨论部分指出，该研究首次在系统水平上同时分析了TP53、CDH1和APC三种关键肿瘤抑制蛋白的临床显著致病性遗传变异。研究发现错义和无义变异是GC中破坏肿瘤抑制功能的主要变异类型，而移码、剪接位点、ncRNA和UTR变异未显示出与GC发病的直接关联。研究揭示了肿瘤抑制蛋白通过翻译后修饰位点改变、蛋白质结构不稳定、原子构象紊乱等多重机制被破坏，且这些破坏作用受EZH2和hsa-miR-129-5p等关键调控元件的协同影响。突变导致的蛋白质功能丧失进一步引发下游致癌基因的表达失调，形成促进GC进展的级联效应。值得注意的是，TP53、CDH1和APC在GC组织中显著上调并影响患者生存，提示这些基因可能作为预后生物标志物。
研究结论指出，胃癌是全球第四大癌症相关死亡原因，理解其发病机制的遗传因素和分子机制对改善GC进展和预防过程具有重要意义。该计算研究揭示了GC通路中关键肿瘤抑制蛋白TP53、CDH1和APC的遗传突变所驱动的关键失稳机制，这些蛋白携带临床显著的致癌性变异。研究采用的新型多层次方法，结合传统方法与基于深度学习的图神经网络建模、生物物理能量分析和无监督机器学习，揭示了通过复杂的分子干扰（包括甲基化和磷酸化位点的改变）破坏蛋白质结构-功能关系的致癌突变。重要的是，研究证明了这些突变如何触发致癌基因表达（TERT、CCNE1、CCNE2、MET和FGFR2）的级联效应，并鉴定了可同时影响三种肿瘤抑制蛋白的关键调控元件（EZH2转录因子和hsa-miR-129-5p）。该研究提供了一个将遗传变异与分子机制联系起来的复杂计算框架，优先排序了用于精准肿瘤学和靶向GC管理的分子组分和变异体，为未来开发联合治疗策略和改进GC患者预后奠定了基础。
