激活的嗅鞘细胞通过IL-10信号通路抑制星形胶质细胞反应性及CSPGs表达——基于体外胶质瘢痕划痕损伤模型的研究

《Brain Research》：Activated olfactory ensheathing cells suppress astrocyte reactivity and CSPGs expression through IL-10 signaling in an in vitro scratch-injury model of glial scarring

　　机械损伤增强纯化星形胶质细胞的反应性，并上调抑制性神经正黏蛋白和NG2的表达。aOECs在体外抑制机械损伤诱导的星形胶质细胞反应性和抑制性CSPGs的表达。aOECs对损伤后星形胶质细胞活化和CSPGs表达的调控作用在很大程度上依赖于IL-10。脊髓损伤是对中枢神经系统的毁灭性且不可逆的损伤，主要由创伤引发。它会导致损伤水平以下的严重感觉和运动功能障碍，给患者及其家庭带来巨大的生理、心理和社会经济负担。目前针对脊髓损伤的临床干预措施，包括手术减压、细胞疗法、生物材料植入和康复训练，主要侧重于缓解并发症和防止继发性进展。然而，现有的策略在恢复神经功能或显著改善长期预后方面仍然有限。脊髓损伤后神经再生的主要障碍是胶质瘢痕的形成，该过程由反应性星形胶质细胞及其过量产生的硫酸软骨素蛋白聚糖所驱动。CSPGs与其他抑制剂一起强力抑制轴突发芽和延伸。因此，开发有效调节星形胶质细胞反应性并减轻胶质瘢痕抑制性微环境的策略，对于神经修复和功能恢复至关重要。为在受控环境中研究胶质瘢痕形成的机制，研究者开发了几种体外模型，包括机械划痕损伤、化学损伤和共培养系统。其中，划痕模型因能够重现体内观察到的反应性星形胶质细胞活化和CSPGs沉积的关键特征而得到广泛应用。因此，我们在纯化的一代星形胶质细胞培养物中使用划痕模型诱导反应性星形胶质细胞活化，从而特异性地考察aOECs对星形胶质细胞反应性的调节作用。近期研究表明，多种细胞类型在脊髓损伤修复中具有治疗潜力，包括干细胞、嗅觉鞘细胞、施万细胞和星形胶质细胞。这些细胞通过分泌神经营养因子、调节炎症反应和促进轴突再生等多种机制促进神经再生。其中，OECs被认为是特别有前景的候选细胞，因其具有强大的神经营养特性及内在的轴突引导能力，非常适合中枢神经系统的修复。越来越多的证据表明，OECs可增强脊髓损伤后的神经再生并调节胶质瘢痕的形成。近期的活体研究证实，在损伤后不同阶段移植OECs可显著降低胶质纤维酸性蛋白和CSPGs的表达，抑制囊腔形成，并抑制反应性星形胶质细胞的过度活化。与此一致的是，体外共培养实验进一步证明，即使在抑制性环境中，OECs也能减轻星形胶质细胞反应性并促进轴突延伸。然而，脊髓损伤后恶劣的炎性微环境往往会严重损害移植OECs的存活和功能完整性，从而限制其治疗效果。因此，开发策略以提高移植OECs在受损脊髓中的韧性和再生能力是当务之急。姜黄素是一种源自姜黄的自然多酚类化合物，因其潜在的抗炎、抗氧化和抗凋亡特性以及优良的安全性而引起了科学界的广泛关注。越来越多的证据凸显了其神经保护潜力。我们之前的研究确定，用1 μM姜黄素处理3天可达到OECs的最佳激活效果。值得注意的是，研究进一步表明，姜黄素不仅能增强OECs的增殖能力，还能促进BDNF、GDNF和NGF等关键神经营养因子以及TGF-β、IL-4和IL-10等抗炎细胞因子的分泌。在机制上，姜黄素激活的OECs通过分泌IL-4促使小胶质细胞向M2表型极化，从而缓解神经炎症。然而，尚不清楚姜黄素是否能有效改善OECs移植的治疗效果，特别是通过调节反应性星形胶质细胞来改善神经损伤后的抑制性微环境。更重要的是，这些细胞事件背后的机制尚未完全阐明。星形胶质细胞对环境信号具有动态反应能力，其活化与慢性炎症密切相关。IL-10作为一种关键的免疫调节细胞因子，已被证明能显著下调A1星形胶质细胞特异性转录本并减少脊髓损伤模型中硫酸软骨素蛋白聚糖的沉积。重要的是，星形胶质细胞组成性表达高水平的IL-10受体，这为IL-10直接调控星形胶质细胞活化提供了机制基础。基于这些发现，我们提出aOECs通过增强IL-10的分泌来减轻星形胶质细胞活化和CSPGs的表达。为验证这一假设，我们通过在培养的星形胶质细胞上机械划痕来在体外诱导星形胶质细胞活化，随后用相应OECs的条件培养基进行处理，并评估反应性星形胶质细胞标志物和CSPGs的表达水平。通过慢病毒介导的基因敲低进一步考察了IL-10的作用。本研究旨在阐明aOECs调节脊髓损伤后星形胶质细胞活化的机制，为基于aOECs的疗法提供理论基础。本研究中，OECs和星形胶质细胞通过原代培养获得。OECs从体重200-250 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠的嗅球组织中分离，星形胶质细胞则从出生后24小时内SD大鼠的脊髓组织中来源。本研究中，一个独立的生物学重复定义为来自不同动物的细胞制备物。所有动物实验程序均经实验室动物福利与伦理委员会批准。为研究aOECs对星形胶质细胞的影响，首先从嗅球中分离并纯化OECs。相差显微镜观察显示，纯化后的细胞呈现出典型的OEC形态，主要表现为双极或多极梭形细胞，具有较高的折光性，其突起相互连接形成简单的网络结构。p75免疫荧光染色证实超过85%的细胞为p75阳性，表明纯度较高。这些...既往研究表明，aOECs显著上调抗炎细胞因子和神经营养因子的分泌，从而改善脊髓损伤后的局部微环境。虽然IL-4通过间接和直接机制调节星形胶质细胞活化，但本研究聚焦于IL-10，因其已通过IL-10R1对星形胶质细胞反应性的直接抑制作用而得到充分证实，并被鉴定为主要效应因子...本研究中，IL-10敲低组的波形蛋白表达显著上调，同时伴随抑制性细胞外基质成分NG2和神经正黏蛋白水平的升高。这些发现表明IL-10直接调节胶质反应性并积极参与细胞外基质重塑。支持这一观点的是，Li等人证实调节Treg细胞来源的IL-10通过调节波形蛋白促进神经损伤后的瘢痕重塑和功能恢复...张丹丹：撰写初稿、验证、项目管理、方法学、概念化。马小雨：方法学。刘子健：软件、形式化分析。苏文欣：可视化、数据管理。李俊平：验证、监督。杨浩：撰写与编辑、验证、经费获取、概念化。宁夏回族自治区重点研发计划；陕西省自然科学基金。作者声明不存在可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。张丹丹 | 马小雨 | 刘子健 | 苏文欣 | 李俊平 | 杨浩