低剂量阿糖胞苷诱导鸡胚原代肌源性细胞衰老模型的建立及其多维度特征鉴定

《Frontiers in Aging》：Unraveling skeletal muscle senescence in an in vitro cell culture model

　　

引言：骨骼肌对随意运动、姿势维持、呼吸和关节稳定至关重要，因此是维持整体健康和生活质量所必需的。衰老、肌肉减少症（sarcopenia）、癌症、固定制动及多种肌肉病变均可影响肌肉功能，而肌肉细胞衰老（muscle cell senescence）与这些状况密切相关。方法：本研究旨在建立一种用于研究骨骼肌细胞衰老的原代细胞培养模型。研究人员使用低浓度阿糖胞苷（cytosine arabinoside, Ara-C）处理培养的鸡胚肌肉细胞9天以诱导细胞周期阻滞（cell cycle arrest）。结果：研究结果表明，Ara-C能够诱导多种细胞衰老相关的典型特征，包括细胞增殖减少、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）表达升高、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加、p53和p21表达上调、肌成纤维细胞体积及细胞核数目增加、溶酶体活性增强、肌肉分化能力降低（表现为肌纤维尺寸减小及结蛋白desmin表达下降），以及IL-6、TNFα和TGFβ分泌增加。值得注意的是，抑制成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor, FGFr）可恢复肌源性细胞中Ara-C诱导的衰老表型。结论：该新型实验模型可用于加深对骨骼肌衰老启动和建立过程中相关分子及信号通路的理解。此外，该模型可用于测试旨在改善衰老相关状况的新药物和治疗干预措施。

研究背景

骨骼肌是人体最大的器官系统，负责随意运动、姿势维持、呼吸驱动和关节稳定，对整体健康和生活质量具有不可替代的作用。随着年龄增长以及多种病理状态的发生，肌肉功能逐渐衰退。细胞衰老（cellular senescence）是指细胞停止分裂并获得一系列特征性变化——包括代谢重编程、形态改变、分泌表型增强、染色质重组及溶酶体区室扩增——的生物学过程。尽管已知细胞衰老在胚胎发育等正常生理过程中发挥作用，但其与肌肉减少症（sarcopenia，一种以肌肉质量和力量进行性丧失为特征的肌肉病变）、癌症、制动固定及多种肌肉退行性病变密切相关。目前，细胞如何进入衰老状态、衰老如何被维持、不同细胞类型的衰老程序存在何种差异等关键问题仍未得到充分解答。骨骼肌细胞因其与衰老和肌肉减少症的密切联系，成为细胞衰老研究中极具价值的研究对象。

开展本研究的动因与方法概述

鉴于现有肌肉细胞衰老研究模型的局限性，研究人员致力于开发一种新型体外模型，以深入理解骨骼肌细胞衰老的分子机制。该研究选用11日龄鸡胚（chick embryo）胸肌组织制备原代肌源性细胞培养物，利用低浓度（150 nM）阿糖胞苷（cytosine arabinoside, Ara-C，一种S期特异性抗代谢物，通过模拟胞苷结构抑制DNA合成和细胞增殖）处理9天以诱导细胞周期阻滞和衰老表型。在关键核心技术层面，研究人员采用了以下方法：从11日龄鸡胚（来源于巴西Granja Tolomei）分离胸肌组织制备原代培养物；SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测衰老标志物；免疫荧光显微术（immunofluorescence microscopy）结合共聚焦成像进行亚细胞定位；免疫印迹法（western blot）分析蛋白表达水平；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测分泌因子；H₂DCFDA荧光探针检测活性氧水平；吖啶橙（acridine orange）和LysoTracker染色评估酸性细胞器和溶酶体活性；苏丹黑B（Sudan Black B）染色检测脂褐素积累；以及利用FGF受体抑制剂SU-5402进行信号通路干预实验。

研究结果

Ara-C诱导β-半乳糖苷酶表达升高及细胞活力评估
SA-β-gal是公认的细胞衰老金标准标志物。研究人员对培养96小时后经150 nM Ara-C处理72小时的鸡胚肌源性细胞进行SA-β-gal染色，结果显示Ara-C处理组β-gal表达增加超过4倍。紫色染色在单核细胞（成肌细胞和成纤维细胞）以及多核肌管中均被观察到，表明衰老表型在培养体系的所有三种主要细胞类型中均有体现。MTT细胞活力测定表明，低剂量Ara-C在原代培养阶段（P0）和恢复培养阶段（P2）均未对细胞活力产生显著影响。

细胞形态学变化与肌肉分化能力下降
通过结蛋白（desmin，肌肉特异性标志物）和flotillin-2（鸡肌肉成纤维细胞标志物）及DAPI三重标记，研究人员实现了对肌管、成肌细胞和成纤维细胞的精确区分。定量分析显示，Ara-C处理导致肌管直径减小、成肌细胞融合指数（myoblast fusion index）降低、成肌细胞和成纤维细胞面积增大、双核成纤维细胞数量增加。鬼笔环肽（Phalloidin）标记F-肌动蛋白（F-actin）进一步揭示了衰老成纤维细胞中应力纤维增多。免疫印迹分析证实desmin蛋白表达水平下降，综合表明肌肉分化在衰老过程中受到抑制。

p53/p21表达上调与细胞增殖抑制
肿瘤抑制蛋白p53和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21均与细胞周期阻滞和细胞衰老密切相关。免疫荧光和免疫印迹结果显示，Ara-C处理后肌源性细胞中p53和p21蛋白表达均显著上调。同时，磷酸化组蛋白H3（phospho-histone H3, pH3，细胞分裂标志物）免疫荧光标记显示衰老细胞中pH3阳性细胞数量大幅减少，确认细胞增殖受到抑制。

酸性细胞器与溶酶体活性增加
利用吖啶橙（AO）和LysoTracker两种荧光探针，研究人员观察到Ara-C处理细胞中酸性区室的显著增加，AO红色荧光信号增强表明酸性细胞器增多，LysoTracker标记在衰老多核肌管中尤为明显，提示溶酶体活性升高是肌肉细胞衰老的重要特征。

活性氧产生增加
H₂DCFDA活细胞荧光探针检测显示，Ara-C处理的肌源性细胞中ROS水平显著升高。该结果与既往老年小鼠离体肌纤维ROS产生增多的研究报道一致，表明氧化应激是肌肉衰老的重要促进因素。

苏丹黑B染色与衰老相关分泌表型
苏丹黑B染色在亮视野下呈现深蓝色、在荧光显微镜远红光通道呈现红色荧光，衰老细胞中染色强度显著增加，提示脂褐素等脂质积累加剧。ELISA定量分析显示，Ara-C处理细胞的条件培养基中IL-6、TNFα和TGFβ分泌水平均显著升高，证实了衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）的激活。值得注意的是，TGF-β1是已知的细胞衰老关键调控因子，可诱导氧化应激介导的p53通路激活；IL-6则被报道可诱导骨骼肌萎缩并可通过自分泌方式放大SASP。

FGF受体抑制挽救衰老表型
鉴于成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路在骨骼肌衰老调控中的作用以及衰老培养物中巨型成纤维细胞的出现，研究人员利用FGF受体抑制剂SU-5402处理对照和衰老肌源性细胞。结果显示，SU-5402处理能够恢复肌源性细胞的肌纤维形成能力，增加desmin阳性肌管面积，表明FGF信号通路参与Ara-C诱导的肌肉衰老表型，其抑制可在一定程度上阻止肌肉细胞衰老。

总结与讨论

本研究成功建立了一种使用低剂量Ara-C诱导鸡胚原代肌源性细胞衰老的新型体外模型。该模型的核心优势在于其与体内肌肉环境的相似性——原代培养体系同时包含肌肉细胞和成纤维细胞，且鸡胚肌源性细胞具有高度的自主分化能力，可形成含数百个细胞核的巨大肌管，无需血清撤除即可完成成肌程序。此外，该模型仅使用单一药物在15天内即可实现肌肉衰老诱导，操作简便。研究人员同时指出，衰老表型与细胞应激表型之间存在紧密交织，Ara-C诱导的ROS增加、SASP激活和溶酶体活性升高均可从细胞应激角度加以理解，这呼应了将细胞衰老视为广义细胞应激反应程序而非单纯无限增殖屏障的学术观点。研究结论为：该新型实验模型可用于加深对骨骼肌衰老启动和建立过程中相关分子及信号通路的理解，并可应用于测试旨在改善衰老相关状况（如肌肉减少症、肌肉废用性萎缩和肌肉营养不良等）的新药物和治疗干预措施。未来研究可进一步比较Ara-C与其他已知衰老诱导剂在该体系中的效应差异，并深入解析FGF受体信号通路在肌肉衰老中的具体分子机制。