X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-ALD）中AMN与CALD表型的成纤维细胞脂质组学比较：鉴定脑型表型的潜在早期脂质预测因子

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Lipid signature in X-ALD: a comparison between phenotypes

　　

背景：X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD）具有高度可变的表型，目前尚无已知的基因型/表型相关性或预测病程的方法。X-ALD筛查可实现肾上腺功能不全和脑脱髓鞘的早期、可能挽救生命的治疗，并可能有助于检测患者的临床前差异以及将治疗扩展至症状前个体。在本研究中，研究人员分析了肾上腺髓鞘神经病（Adrenomyeloneuropathy, AMN，即晚发型缓慢进展型X-ALD）患者和脑型肾上腺脑白质营养不良（Cerebral Adrenoleukodystrophy, CALD，即儿童早期脑炎性脱髓鞘型）患者成纤维细胞中的脂质特征，旨在鉴定特定的脂质分子作为CALD的潜在早期预测因子。

方法：研究人员使用Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱（UHPLC）系统，联用Q-Exactive质谱仪，分析了n=4例经临床确诊（并经遗传学证实）的X-ALD患者（2例CALD和2例AMN）和n=4例年龄匹配对照的成纤维细胞脂质组学谱。

结果：研究结果突出了AMN和CALD成纤维细胞相对于对照的脂质代谢改变，进一步证实了LPC 26:0作为X-ALD潜在生物标志物的作用。然而，两种表型之间脂质重塑的程度和模式存在实质性差异，CALD患者中涉及中性脂质的贡献，以及神经节苷脂（gangliosides）的选择性参与。

结论：尽管AMN和CALD成纤维细胞共享一些疾病相关的脂质改变，但CALD样本在多个脂质类别中表现出更广泛和更显著的扰动，特别是在溶血磷脂酰胆碱（LPC）和甾醇酯（steryl esters）中。表型相关脂质特征的鉴定可能代表X-ALD迈向精准医学的一步，以改善患者的表型评估。

**论文解读**

**一、研究背景与目的**

X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD）是一种由ABCD1基因致病性变异引起的过氧化物酶体神经代谢性疾病，该基因变异导致ABCD1转运蛋白功能障碍，而该转运蛋白为极长链脂肪酸（very long chain fatty acids, VLCFA）β-氧化所必需。近年来，多个国家已将X-ALD纳入新生儿筛查（newborn screening, NBS）项目，美国于2013年率先在纽约实施，随后在全美推广；中国、印度和荷兰的试点研究正在进行中。在意大利，伦巴第大区于2021年启动了区域试点研究，其他几个大区也在进行中。

X-ALD面临的一个主要挑战不仅在于诊断，还在于当前筛查策略的局限性。检测主要依赖VLCFA蓄积，其中C26:0-溶血磷脂酰胆碱（LPC 26:0）作为主要生物标志物和X-ALD的潜在介质。然而，尽管对治疗决策至关重要，预测临床疾病表型目前仍未解决。根据发病年龄、神经系统病变部位和疾病进展，X-ALD的表型表现包括：进展性脑型X-ALD（CALD）、可向肾上腺髓鞘神经病（AMN）演变的单纯Addison病型，以及无症状或轻度受累携带者。约40%携带ABCD1致病性变异的患者在儿童期发展为CALD，伴随快速进展的炎性脱髓鞘，若不及时治疗则致命且进展通常迅速。

ABCD1基因的遗传学分析被广泛认为是疾病诊断的可靠且确定的方法，包括靶向测序和下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）或全外显子组测序方法。已报道超过1040种基因变异，但未发现基因型与表型之间的相关性。事实上，相同的ABCD1突变在不同个体中可导致CALD、AMN或Addison病，甚至在遗传学完全相同的同卵双胞胎中也可出现不同表型，这证明遗传背景并非该疾病表型异质性的唯一决定因素。

VLCFA蓄积，特别是LPC 26:0，是X-ALD的主要生化标志物。LPC 26:0来源于VLCFA-CoA物种的积累，后者通过溶血磷脂酰基转移酶LPLAT10掺入磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine），随后经磷脂酶A₂介导的水解生成。中枢神经系统脂蛋白中LPC 26:0的积累被认为与实验模型中观察到的神经毒性和促炎效应有关，近期证据表明高水平的LPC 26:0与严重脊髓疾病和脑型ALD之间存在相关性。神经丝轻链（neurofilament light chain）含量也被提议作为CALD早期检测的预后生物标志物，作为当前神经影像学预测因子的补充。然而，尽管已开展了多项多组学分析，目前仍缺乏能够预测CALD的基于生物标志物的风险谱。VLCFA过载的程度本身与疾病严重程度不相关，且不能完全解释患者的临床表型。

在此背景下，研究人员应用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向脂质组学方法，分析了来自n=2例AMN患者、n=2例CALD患者和n=4例年龄匹配健康对照的皮肤成纤维细胞脂质谱，旨在鉴定可能用于症状前个体早期预测的脂质特征，并可能定义发展为脑型疾病的风险谱。

**二、主要技术方法**

本研究采用以下关键技术方法：①皮肤活检获取成纤维细胞，样本来源于n=4例经临床确诊并经遗传学证实的X-ALD患者（2例CALD儿童患者和2例AMN成人患者）及n=4例年龄匹配的健康对照，患者活检在诊断时进行，均未接受药物治疗或特殊饮食，研究经OPBG伦理委员会批准（2058, 2018年6月1日）；②采用MMC混合物（甲醇:甲基叔丁基醚:氯仿，40:30:30，v:v:v）进行脂质提取，该方案具有广泛的脂质覆盖度并减少样品操作；③使用Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱（UHPLC）系统联用Q-Exactive Orbitrap质谱仪进行非靶向脂质组学分析，采用正负离子极性切换模式；④使用Lipostar2软件进行原始数据管理、峰检测、特征对齐、空白扣除、脂质鉴定及多变量统计分析；⑤采用主成分分析（PCA）评估数据质量和样本聚类，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）识别对组间分离有贡献的脂质，以变量投影重要性（VIP）>1为筛选标准；⑥单变量分析采用Welch校正的非配对t检验，以Benjamini-Hochberg程序校正p值，以校正p值<0.05和倍数变化（FC）>2为显著性阈值。

**三、研究结果**

**（一）AMN成纤维细胞的脂质组学特征**

对第一个数据集（n=2例AMN成纤维细胞与n=2例成人对照）的分析共鉴定出约600种脂质物种，涵盖多个类别。甘油磷脂（glycerophospholipids）是最丰富的脂质类别，其中二酰基甘油磷酸胆碱（diacylglycerophosphocholines, PC, n=132）最多，其次为醚连接PC（ether-PC, n=72）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines, PE, n=59）。无监督PCA显示AMN成纤维细胞与健康对照沿第一主成分（PC1）呈现明显分离，表明患者来源细胞整体脂质代谢的显著改变。OPLS-DA模型进一步证实两组沿预测成分（LV1，解释51%总方差）的稳健分离，约200种脂质的VIP>1。单变量分析整合显示，AMN成纤维细胞的整体脂质组学谱以普遍下调为特征，包括PC类（n=20）、ether-PC（n=18）、PE（n=11）和ether-PE（n=11）以及鞘脂类（sphingolipids），包括鞘磷脂（sphingomyelins, SM, n=12）、神经酰胺（ceramides, Cer, n=8）和神经节苷脂（n=4）均显著降低。在LPC类（共鉴定11种）中，LPC 26:0的VIP为0.95，虽未达到>1阈值，但因其已知的生物学相关性而保留进一步考量，且LPC 26:0是AMN患者相对于对照少数升高的脂质之一。

**（二）CALD成纤维细胞的脂质组学特征**

第二个数据集（n=2例CALD儿童患者成纤维细胞与n=2例儿童对照）共鉴定出约1300种脂质物种。最丰富的脂质类别为PC（n=412）、PE（n=146）、甘油三酯（triglycerides, TG, n=129）以及ether-PC（n=108）和ether-PE（n=92）。PCA显示患者与对照沿PC1（解释41.29%方差）的清晰分离。OPLS-DA模型显示CALD成纤维细胞与对照沿LV1（解释71.98%总方差）的完全分离，224种脂质的VIP>1，其中PC类（n=98）贡献最大，且具有较长酰基链和较高不饱和度的PC在患者中更丰富；TG（n=27）为第二大类，均升高且总碳数均大于54。几乎所有鉴定的甾醇酯（steryl esters, SE）VIP>1且均在患者中升高。在鞘脂中，仅神经节苷脂（9/38种）对组间区分有贡献且均升高，而神经酰胺和鞘磷脂无相关贡献。单变量与多变量分析的交叉产生了140种满足所有选择标准（VIP>1、校正p<0.05、FC>2）的脂质。在LPC类（共25种）中，LPC 26:0和LPC 28:0是仅有的两种满足所有选择标准的物种，均在CALD患者中显著升高。

**（三）AMN与CALD脂质特征的比较**

两个数据集的比较评估揭示了AMN和CALD成纤维细胞之间共享和独特的脂质组学特征。在AMN数据集中，大多数显著变化的脂质物种（包括PC、ether-PC和鞘脂）在患者中降低。相比之下，CALD数据集以脂质物种普遍升高为特征，特别是PC、TG、SE和神经节苷脂。在鞘脂类别中，AMN表现出更广泛的鞘脂参与（神经节苷脂、神经酰胺和鞘磷脂均受影响），而CALD中仅神经节苷脂对组间区分有贡献。LPC 26:0在两种表型中均相对于对照升高，但其他LPC物种在AMN患者中全部降低，而在CALD中LPC 26:0与LPC 28:0一同升高。两种OPLS-DA模型均通过留一法交叉验证（LOOCV），显示出良好的拟合优度（R²=1.000）和良好至优秀的预测能力（AMN模型Q²=0.576，CALD模型Q²=0.986）。

**四、讨论与结论**

脂质异常在X-ALD中早有报道，包括VLCFA在复杂脂质中的积累，如甘油磷酸胆碱、胆固醇酯和甘油三酯。这些变化可能改变膜结构和功能，促进疾病进展和演变。研究人员的总体数据表明，尽管成纤维细胞并非X-ALD中最受累的细胞类型（如少突胶质细胞和星形胶质细胞），但它们是一种易于获取且不受饮食、药物治疗影响的可再生细胞来源，能够充分重现X-ALD的主要特征（VLCFA积累、自由基过载、能量代谢障碍）。

在鞘脂方面，AMN特征中鞘脂有强烈贡献，而CALD中仅神经节苷脂参与。鉴于神经节苷脂在膜组织和信号传导中的作用，这种选择性参与可能反映了AMN中慢性的膜结构改变。反之，甘油三酯主要在CALD中升高，提示在更严重的表型中脂质储存增强。值得注意的是，氧化还原失衡也可能对观察到的脂质重塑有贡献。研究人员此前的研究（Petrillo等人，2022）报道了X-ALD成纤维细胞中显著的氧化还原障碍，CALD样本的脂质过氧化水平显著高于AMN样本，提示氧化应激可能是X-ALD脂质改变的额外驱动因素。

在LPC物种方面，LPC 26:0在两种表型中均升高，确认其诊断价值；而LPC 28:0仅在CALD中检测到，提示其对脑型表型的潜在特异性以及作为LPC 26:0补充标志物的可能。总体而言，AMN和CALD共享成纤维细胞中的脂质重塑，但模式不同：AMN显示更广泛的鞘脂参与，而CALD以中性脂质升高和储存途径激活为特征。从生物标志物角度看，鞘脂改变可能表征AMN，而甘油三酯、甾醇酯和LPC 28:0升高可能定义CALD。

从机制角度，目前已知脂质变化与X-ALD疾病进展之间的关系是：由ABCD1缺陷引起的脂质组成改变可诱导细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）进入反应状态，分泌神经毒性介质，增加细胞对铁死亡（ferroptosis）的易感性和神经炎症，最终导致神经变性和加速疾病进展。特别是，VLCFA掺入髓鞘脂质的增加可能改变其结构致密性，提供了VLCFA脂质积累与早期白质病理之间的机制联系。

需强调的是，由于患者队列有限，本研究应被视为一项初步探索性研究。因此，研究人员有意将解读限制在最一致的发现上，特别是那些有先前证据支持的发现，而将其余脂质改变视为需要在更大独立队列中验证的探索性观察。尽管如此，这些发现可能为鉴定CALD脂质预测因子和表型特异性脂质谱以支持早期患者分层提供基础，这在X-ALD已被纳入新生儿筛查的背景下尤为重要。此外，LPC物种的重塑可能代表X-ALD以外其他溶酶体脂质贮积症的共同致病特征，如Mishra等人（2024）近期对Niemann-Pick C1型疾病的报道。

**研究结论**：尽管AMN和CALD成纤维细胞共享一些疾病相关的脂质改变，但CALD样本在多个脂质类别中表现出更广泛和更显著的扰动，特别是在LPC和甾醇酯中。表型相关脂质特征的鉴定可能代表X-ALD迈向精准医学的一步，以改善患者的表型评估。