《Frontiers in Tropical Diseases》：Comparative assessment of three methods (Chelex-based method, commercial kit, and CTAB-based method) for extracting DNA from Whatman filter paper on which urine samples were filtered and stored for molecular diagnosis of urinary schistosomiasis
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摘要
引言：尿液样本的储存以及获得不含PCR抑制剂的DNA提取物仍然是尿血吸虫病分子诊断面临的严峻挑战。本研究旨在应对这些挑战，评估三种DNA提取方法在使用Whatman滤纸过滤并储存尿液样本进行尿血吸虫病分子诊断中的效率。
方法：研究人员从Matta卫生区的
摘要
引言：尿液样本的储存以及获得不含PCR抑制剂的DNA提取物仍然是尿血吸虫病分子诊断面临的严峻挑战。本研究旨在应对这些挑战，评估三种DNA提取方法在使用Whatman滤纸过滤并储存尿液样本进行尿血吸虫病分子诊断中的效率。
方法：研究人员从Matta卫生区的学龄儿童中收集尿液样本，并使用尿液过滤试验进行分析。本研究选取了120份含S. haematobium虫卵和54份不含虫卵的尿液样本，将其过滤通过打孔的Whatman滤纸并储存长达20周。在不同时间点使用三种DNA提取方法从这些滤纸中提取DNA。通过扩增S. haematobium的特异性片段，评估了这些提取方法的性能以及滤纸储存S. haematobium DNA数周的能力。
结果：所有使用基于Chelex的方法获得的DNA提取物在Whatman滤纸上保存尿液长达12周时均成功扩增，而基于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的方法的扩增率随时间从99.2%下降至96.7%。根据不同储存时间比较扩增率时，在Whatman滤纸上保存尿液12周（P = 0.0007）和20周（P < 0.0001）后，使用基于Chelex的方法获得的提取物的扩增率显著高于使用其他提取方法获得的提取物。使用基于Chelex的方法，PCR的灵敏度和特异性范围分别为99.2%至100%和77.8%至83.3%。
结论：本研究证明了基于Chelex的方法在提取保存于这些滤纸上的S. haematobium DNA方面的性能。基于Chelex的方法的提取成本（�0.24）显得可靠，且至少比基于CTAB的方法和商业试剂盒具有2倍以上的成本效益。将该方法与Whatman滤纸上的尿液储存相结合，可改善尿血吸虫病的诊断、监测和消除监测。
论文解读
血吸虫病（schistosomiasis）是影响贫困农村地区的最常见被忽视热带病之一，约2.29亿人感染，其中S. haematobium导致尿血吸虫病，在非洲影响约1.12亿人。世界卫生组织（WHO）推荐以大规模预防性化疗（preventive chemotherapy, PC）为主要控制策略，使患病率和感染强度显著下降，并纳入2021—2030年被忽视热带病路线图，目标是在2030年作为公共卫生问题消除。随着患病率下降，需要高灵敏度和特异性的诊断工具来验证消除、监测和评估控制项目及消除后监测。尿液过滤试验（urine filtration test, UF）是诊断S. haematobium感染的金标准，但在低强度感染时敏感性低；即时检验循环阴极抗原（POC-CCA）对尿血吸虫病敏感性较差。分子工具可检测种特异性DNA，但尿液中含有PCR抑制剂（如尿素、晶体、亚硝酸盐和血红蛋白），且样本储存和DNA纯化成本是挑战。商业试剂盒成本高，而CTAB法等方法在尿液样本上的性能未知。Whatman滤纸已被用于储存尿液，但其长期储存能力和流行病学价值未充分评估。因此，该研究旨在评估三种DNA提取方法（Chelex法、CTAB法和商业试剂盒）从Whatman滤纸上过滤并储存的尿液样本中提取S. haematobium DNA的效率。
研究人员在喀麦隆Matta卫生区开展研究，收集学龄儿童尿液样本，通过尿液过滤试验筛选出120份含S. haematobium虫卵和54份不含虫卵的样本，过滤到打孔的Whatman No.3滤纸圆片上，在室温下储存长达20周。使用三种DNA提取方法在不同时间点（1、3、12、20周）提取DNA，通过扩增S. haematobium的特异性COX1基因片段（365 bp）评估提取效率和储存能力。结果显示，Chelex法在所有时间点均保持高扩增率（3周和12周为100%，20周为99.2%），显著优于CTAB法（99.2%、97.5%、96.7%）和商业试剂盒（100%、90.8%、80%）在12周和20周后的表现。基于54份无卵样本，Chelex法在12周时特异性为83.3%，灵敏度为100%，20周时分别为77.8%和99.2%。成本方面，Chelex法每样本�0.24，远低于CTAB法（�0.70）和商业试剂盒（�2.2—�16.5）。结论认为，Chelex法结合Whatman滤纸储存尿液是成本效益高、简便可靠的策略，可用于尿血吸虫病的诊断、监测和消除验证。
主要技术方法如下：研究人员从喀麦隆Matta卫生区四所公立小学招募学龄儿童，采集约50 mL尿液，在Matta综合卫生中心用尿液过滤试验进行虫卵镜检。使用自制打孔器将Whatman No.3滤纸制成13 mm直径圆片，用注射器过滤10 mL尿液，室温储存于含干燥剂的塑料袋中。在储存1、3、12、20周时，每张滤纸圆片分成两半，分别采用三种方法提取DNA：基于Chelex树脂的方法、基于CTAB的方法和商业试剂盒（Quick-DNA Miniprep Plus Kit, Zymo Research）。通过PCR扩增S. haematobium的细胞色素氧化酶1（COX1）基因片段（引物ShF/CR），产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测365 bp条带。使用R 4.2.0软件进行卡方检验，Medcalc软件计算诊断性能。
研究结果如下：3.1 所用尿液样本特征：共分析174份尿液样本，其中120份经尿液过滤试验证实含S. haematobium虫卵，54份不含虫卵。样本选择标准为有足够尿液至少过滤到6张滤纸圆片。3.2 三种DNA提取方法从滤纸提取S. haematobium DNA的性能：对20份储存1周的尿液样本，三种提取方法获得的DNA均成功扩增出365 bp的S. haematobium COX1 DNA片段，扩增率均为100%。3.3 Whatman滤纸过滤尿液和储存成分用于分子检测的能力：对120份含虫卵样本，Chelex法在3周和12周储存后扩增率均为100%，20周后降为99.2%；CTAB法分别为99.2%、97.5%和96.7%；商业试剂盒分别为100%、90.8%和80%。统计显示，在12周（P=0.0007）和20周（P<0.0001）时，三种方法间扩增率差异显著，Chelex法最高。对54份无卵样本，12周时Chelex法检出9份（16.7%）阳性，CTAB法检出17份（31.5%）。3.4 Chelex和CTAB DNA提取方法用于S. haematobium感染的分子诊断性能：以尿液过滤试验为参考，Chelex法在12周时灵敏度100%、特异性83.3%、阴性预测值（NPV）100%、阳性预测值（PPV）93%，kappa=0.87；20周时分别为99.2%、77.8%、97.7%、90.8%，kappa=0.81。CTAB法在12周时灵敏度97.5%、特异性68.5%、NPV 92.5%、PPV 87.3%，kappa=0.71；20周时分别为96.7%、63%、89.5%、85.3%，kappa=0.65。两种方法比较，Chelex法检出率高于CTAB法约6.3个百分点，差异显著（P=0.001）。3.5 DNA提取成本评估：Chelex法每样本成本�0.24，CTAB法�0.70，商业试剂盒每样本�2.2至�16.5。提取时间方面，Chelex法约需1小时，CTAB法和商业试剂盒超过24小时。
讨论部分指出，研究证实Whatman滤纸可长时间储存尿液成分用于分子检测。Chelex法因Chelex树脂的碱性和高温处理，能有效裂解虫卵膜并螯合金属离子保护DNA，获得无抑制剂的DNA。CTAB法通过氯仿/异戊醇抽提去除抑制剂，但长时间储存后扩增率下降。商业试剂盒在12周和20周后扩增率显著降低，可能因残留PCR抑制剂。Chelex法成本低、简便快速，适合资源有限地区的大规模流行病学调查。但需注意，参考方法尿液过滤试验本身敏感性低，因此评估的分子方法性能需谨慎解释。
研究结论可翻译为：该研究展示了Whatman滤纸在分子诊断前运输和储存尿液样本长达20周的潜力。在评估的DNA提取方法中，基于Chelex的方法因其简便、快速、经济且诊断性能稳健而成为最合适的方法。这些发现凸显了将Whatman滤纸尿液过滤与基于Chelex的DNA提取相结合，作为S. haematobium分子检测的成本效益策略的潜力，尤其是在商业提取试剂盒获取受限的资源有限地区。该方法可促进大规模流行病学调查，以监测和评估控制项目、验证血吸虫病消除并确保消除后监测。
