《Cell Communication and Signaling》：NheABC is a pH-dependent cytotoxin that targets mitochondria and contributes to the virulence of Bacillus cereus in wound infections
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蜡样芽孢杆菌群（*Bacillus cereus* group）成员是一类革兰氏阳性、产芽孢、兼性厌氧菌，广泛分布于环境中。致病性蜡样芽孢杆菌群菌株与多种疾病和感染相关，包括严重的非胃肠道感染，如伤口感染。在本研究中，研究人员发现
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蜡样芽孢杆菌群（*Bacillus cereus* group）成员是一类革兰氏阳性、产芽孢、兼性厌氧菌，广泛分布于环境中。致病性蜡样芽孢杆菌群菌株与多种疾病和感染相关，包括严重的非胃肠道感染，如伤口感染。在本研究中，研究人员发现，在 tested 的产孔形成毒素（pore-forming toxin, PFT）细菌菌株中，蜡样芽孢杆菌群菌株75/95可诱导上皮细胞显著的膜透化，这促使研究人员探讨其三元NheABC毒素对宿主细胞损伤的贡献。NheABC在2D上皮细胞培养物以及3D球体和肠道类器官中均表现出强烈的细胞膜通透性，并对细胞膜和线粒体产生显著影响。利用脂质体泄漏实验进行的功能分析表明，心磷脂（cardiolipin, CL）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）可促进NheABC介导的膜透化，提示膜脂质组成有助于NheABC活性和线粒体损伤。此外，以红细胞和上皮细胞为模型系统，研究人员进一步证明NheABC的溶细胞活性具有pH依赖性，且在酸性条件（pH 5.5）下显著降低。该pH依赖性通过脂质体泄漏实验得到独立证实。重要的是，在小鼠伤口感染模型中，NheABC增强了细菌定植和局部炎症反应。总之，该研究强调了线粒体和pH在调节NheABC介导的哺乳动物细胞溶细胞活性中的关键作用，这可能为开发治疗蜡样芽孢杆菌群相关胃肠道和非胃肠道感染的新策略提供基础。
**论文解读文章**
**研究背景与科学问题**
细菌感染是全球发病率和死亡率的主要原因之一，其中伤口感染等非胃肠道感染日益受到关注。致病性革兰氏阳性和阴性细菌在感染宿主过程中会分泌孔形成毒素（pore-forming toxins, PFTs），这类毒素是细菌重要的毒力因子，通过插入宿主细胞膜形成寡聚孔道，导致细胞膜透化和细胞裂解，从而促进细菌在宿主内的定植和系统扩散。PFTs根据跨膜区二级结构可分为α-PFTs和β-PFTs，其中α-PFTs包括单组分、双组分和三组分毒素。蜡样芽孢杆菌群（*Bacillus cereus* group）是广泛分布于环境中的革兰氏阳性产芽孢菌，其致病菌株可引起食源性胃肠道疾病以及皮肤、软组织和伤口感染等非胃肠道疾病。慢性伤口因血液、组织液及氨等代谢产物存在，pH通常偏向碱性，可能有利于包括致病性蜡样芽孢杆菌群菌株在内的细菌病原体生长和定植。尽管不同蜡样芽孢杆菌群菌株的致病风险存在差异，但几乎所有菌株均携带非溶血性毒素NheABC编码基因。NheABC是由nheA、nheB和nheC基因编码的三元孔形成毒素，三个组分以10:10:1摩尔比共同作用才能发挥完整溶细胞活性。然而，NheABC在伤口感染中的具体作用机制尚不清楚，特别是其靶向细胞器、膜脂质识别及pH依赖性等关键问题有待阐明。
**研究目的与模型选择**
传统二维（2D）细胞培养模型虽广泛应用于细菌感染机制研究，但缺乏细胞间相互作用、功能性紧密连接及复杂细胞外微环境，难以真实反映体内组织生理状态。三维（3D）细胞培养模型如球体和类器官，能够模拟体内微结构和细胞-基质相互作用，近年来在感染生物学领域日益受到重视。本研究旨在利用2D上皮细胞单层、3D球体、肠道类器官以及小鼠伤口感染模型，系统解析蜡样芽孢杆菌75/95菌株（B. cereus 75/95）产生的NheABC毒素对宿主细胞膜和线粒体的损伤机制，并评估其在伤口感染中的毒力贡献。
**主要技术方法**
研究人员首先利用HCT116、HCT8、DLD1和Caco-2等上皮细胞系，通过细菌感染和细菌游离上清处理，结合碘化丙啶（propidium iodide, PI）和Hoechst 33342染色及SparkCyto成像系统评估细胞膜透化程度。采用MTS实验检测细胞活力，利用四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine, methyl ester, TMRM）染色评估线粒体膜电位。通过HoloMonitor全息显微镜观察细胞形态变化。利用荧光共聚焦显微镜分析线粒体形态及NheA/NheB与线粒体标志物Fis1的共定位。采用亚细胞分级分离和Western blot检测NheA和NheB在细胞质和线粒体组分中的分布。脂质体泄漏实验采用磺基罗丹明B（sulforhodamine B）包裹的脂质体，分别制备大肠杆菌脂质提取物、合成脂质PC:PE（70%:30%）和PC:PE:CL（40%:30%:30%）脂质体，分析NheABC的膜裂解活性及脂质特异性。红细胞溶血实验和浊度实验用于检测NheABC的溶血活性和pH依赖性。人体伤口感染相关蜡样芽孢杆菌群基因组数据来自BTyperDB数据库，共获取41个基因组，经Mashtree建树和BTyper3分析毒素基因分布。小鼠伤口感染模型采用BALB/c小鼠和NF-κB报告基因小鼠，通过创面细菌载量测定和IVIS生物发光成像评估NheABC对细菌定植和局部炎症反应的影响。
**主要研究结果**
**1. 细菌孔形成毒素诱导2D培养上皮细胞膜透化**
研究人员将HCT116细胞暴露于多种产PFT细菌（感染复数MOI=50）或对应细菌游离上清液4小时，经PI和Hoechst 33342染色及SparkCyto成像分析发现，产三元NheABC毒素的蜡样芽孢杆菌75/95菌株诱导最高水平的上皮细胞膜透化，显著高于其他测试菌株。相比之下，同样产三元毒素的粘质沙雷氏菌（*Serratia marcescens*）也诱导了较高水平的膜透化，但该菌还产生β-PFT ShlA，可能共同作用。大肠杆菌536（产α-溶血素）作为阳性对照，枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*，不含PFT）作为阴性对照。其他产三元或双组分毒素的细菌（如嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、发光杆菌）未能诱导显著膜透化。野生型75/95菌株的细菌游离上清液同样诱导最高膜透化水平，而缺失nheBC组分的突变株（75/95ΔnheBC）诱导的膜透化显著减弱，表明NheABC是介导上皮细胞膜损伤的主要毒力因子。MTS实验显示细胞活力丧失与膜透化程度直接相关。全息显微镜观察到HCT8细胞在暴露于野生型上清液后出现显著形态学改变。此外，野生型上清液处理HCT8细胞30分钟即导致线粒体缩短和圆形化，表明NheABC可能直接靶向上皮细胞线粒体。
**2. 三元毒素NheABC导致靶上皮细胞代谢瘫痪**
DLD1细胞经野生型75/95菌株或其上清液处理后，TMRM阳性细胞数量显著减少，表明线粒体膜电位丧失；而突变株处理组与对照组无显著差异。随时间监测发现，野生型上清液处理后15分钟内细胞总ATP水平迅速下降约50%，而细胞膜透化在60分钟时才达到约50%。这一时间差提示线粒体可能是NheABC的首要靶点，线粒体功能障碍可能先于质膜破裂。脂质体泄漏实验显示，野生型上清液可诱导大肠杆菌脂质提取物脂质体及合成脂质脂质体的时间依赖性泄漏，其中PC:PE:CL（40%:30%:30%）脂质体泄漏程度显著高于PC:PE（70%:30%）脂质体，表明心磷脂（CL）和磷脂酰乙醇胺（PE）可促进NheABC介导的膜透化。突变株上清液对PC:PE:CL脂质体的泄漏作用微弱，证实该效应具有NheABC特异性。这些结果共同表明NheABC可能通过靶向线粒体膜中富含的CL和PE发挥溶细胞活性。
**3. NheABC三元毒素组分在靶上皮细胞线粒体中积累**
通过亚细胞分级分离和Western blot分析，研究人员在暴露于野生型上清液的DLD1细胞的细胞质和线粒体组分中均检测到NheA和NheB蛋白，而细胞核组分中未检测到。共聚焦显微镜进一步证实NheA和NheB与线粒体外膜标志物Fis1共定位，皮尔逊相关系数分析确认了共定位程度。这些结果直接证明NheABC毒素组分能够转位至靶细胞线粒体。
**4. NheABC在3D球体和类器官中诱导细胞膜通透性**
利用HCT116和DLD1细胞制备3D球体，暴露于野生型75/95菌株或突变株后，野生型菌株导致球体结构破坏，几乎完全丧失球体核心，PI阳性细胞数量显著增加。时间动力学实验显示PI染色随感染时间延长而增加。FITC-Dextran渗透实验进一步证实野生型菌株增加了球体内部通透性。在肠道类器官模型中，野生型75/95菌株感染4小时显著增加了类器官的细胞膜透化，TMRM染色显示线粒体膜电位丧失。这些结果与2D细胞培养结果一致，表明NheABC在复杂3D细胞系统中同样靶向细胞膜和线粒体。
**5. NheABC对哺乳动物细胞膜的靶向作用具有pH依赖性**
人类红细胞溶血实验显示，野生型75/95上清液在4小时内引起几乎完全溶血，而突变株上清液无溶血活性。浊度实验显示红细胞裂解呈浓度和时间依赖性。抗体中和实验中，抗NheA单克隆抗体（1G4）部分中和NheABC介导的红细胞裂解，而抗NheB单克隆抗体（1E11）几乎完全阻断，证明裂解活性由NheABC特异性介导。遗传互补实验（75/95ΔnheBC/pnheBC）恢复了一系列溶血表型。在不同pH条件下（pH 5.5至8.0），红细胞裂解在pH 8.0时最高，酸性pH下显著降低。脂质体泄漏实验在pH 5.5时同样观察到NheABC介导的泄漏减少，证实了pH依赖性。在DLD1和HCT8上皮细胞中也确认了酸性pH对NheABC膜损伤活性的抑制作用。
**6. 多种蜡样芽孢杆菌群菌株已从人类伤口中分离**
通过BTyperDB数据库分析，研究人员鉴定出41个高质量的人类伤口感染来源的蜡样芽孢杆菌群基因组，这些基因组具有高度多样性，涵盖多个panC系统发育组（IV组43.9%、III组26.8%、II组22.0%、V组2.4%）。毒素基因检测显示，97.6%（40/41）的伤口分离株携带nheABC基因，75.6%（31/41）携带hbl基因，58.5%（24/41）携带cytK-2基因。所有基因组均不含有炭疽毒素基因和脑毒素合成酶基因。值得注意的是，一株panC IV组菌株SJ-S28在默认阈值和降低至0%的阈值下均未检测到nheABC，这是已知的罕见的Nhe阴性菌株。
**7. NheABC促进蜡样芽孢杆菌75/95在伤口感染中的成功定植**
在小鼠切除性伤口感染模型中，感染野生型75/95菌株的小鼠在感染后第2天和第5天的伤口细菌载量均显著高于感染突变株的小鼠，表明NheABC增强了细菌在伤口部位的定植能力。利用NF-κB报告基因小鼠进行活体生物发光成像，野生型菌株诱导的局部炎症反应显著强于突变株。这些结果证明NheABC在非胃肠道伤口感染中发挥重要毒力作用，与其在胃肠道感染中的作用相似。
**总结与讨论**
本研究系统阐明了蜡样芽孢杆菌75/95菌株产生的三元孔形成毒素NheABC的致病机制。研究发现NheABC不仅靶向宿主细胞质膜，更能直接转位至线粒体并造成线粒体损伤，导致线粒体膜电位丧失和细胞ATP快速耗竭。通过脂质体泄漏实验鉴定出心磷脂（CL）和磷脂酰乙醇胺（PE）是促进NheABC活性的关键膜脂质组分，这与线粒体膜富含CL和PE的组成特征相吻合。更关键的是，该研究首次证明NheABC的溶细胞活性具有pH依赖性：在偏碱性环境（pH 7.4至8.0）中活性最高，而酸性pH（5.5）显著抑制其活性。这一特性与慢性伤口通常处于碱性pH环境（7.2至9.0）的临床观察高度一致，提示局部微环境pH可能是调控NheABC毒力的重要因素。
生物信息学分析表明，人类伤口感染来源的蜡样芽孢杆菌群分离株中NheABC编码基因携带率高达97.6%，凸显了该毒素在临床相关菌株中的普遍性。小鼠伤口感染模型进一步证实NheABC对细菌定植和局部炎症反应的关键贡献。该研究将体外2D/3D细胞模型与体内动物模型相结合，揭示了膜脂质组成和环境pH作为NheABC活性的重要决定因素，为理解蜡样芽孢杆菌群引起的伤口感染机制提供了新的视角，并为开发靶向NheABC pH依赖性活性的新型治疗策略奠定了理论基础。研究结论表明，NheABC不仅靶向哺乳动物细胞膜和线粒体，还增强细菌在伤口感染模型中的定植和炎症反应，提示局部微环境可能增强毒素介导的组织损伤和细菌持续存在，未来研究需直接测量感染伤口的pH值以进一步验证这一模型。
