杆状病毒 - 昆虫细胞全细胞生物催化平台的开发及其在 N-乙酰神经氨酸生物合成中的应用

《Journal of Biological Engineering》：A baculovirus–insect cell whole-cell biocatalysis platform for NeuNAc biosynthesis

　　

摘要

工业生物催化应用经常受到重组酶溶解性差和传统微生物表达系统中功能回收有限的限制。为了应对这一挑战，我们开发了一个杆状病毒 - 昆虫细胞全细胞生物催化平台，并以 N-乙酰神经氨酸 (NeuNAc) 生物合成作为模型系统评估了其可行性。对三种异源表达宿主——大肠杆菌、毕赤酵母和杆状病毒感染昆虫细胞——的比较分析表明，在本研究评估的基线表达条件下，昆虫细胞为 GlcNAc 2-差向异构酶 (2ep) 和 NeuNAc 醛缩酶 (NanA) 提供了更高的可溶性酶回收率和工艺级生物转化性能。使用杆状病毒感染的 Sf9 细胞，建立了用于顺序和一锅法生物催化的纯化酶和全细胞两种配置。全细胞系统无需蛋白质纯化即可实现直接转化，并在实验室规模一锅法条件下，根据其与标准品 HPLC 保留时间的一致性，将产物鉴定为 NeuNAc，转化率约为 23%。工艺优化确定了悬浮培养、感染、底物浓度和催化剂负载的合适条件，并使用在 3 升生物反应器中生产的细胞进一步评估了该平台。除了简化催化剂制备外，全细胞策略还减少了纯化酶工作流程相关的功能催化剂制备要求。虽然全面的技术经济评估超出了本工作的范围，但初步的实验室规模成本估算表明全细胞工作流程的原材料支出较低。总体而言，该平台为酶溶解性、折叠或功能表达限制传统微生物宿主性能的生物催化应用提供了一种概念验证性的补充策略。

工业生物催化应用经常受到重组酶溶解性差和传统微生物表达系统中功能回收有限的限制。为了应对这一挑战，我们开发了一个杆状病毒 - 昆虫细胞全细胞生物催化平台，并以 N-乙酰神经氨酸 (NeuNAc) 生物合成作为模型系统评估了其可行性。对三种异源表达宿主——大肠杆菌、毕赤酵母和杆状病毒感染昆虫细胞——的比较分析表明，在本研究评估的基线表达条件下，昆虫细胞为 GlcNAc 2-差向异构酶 (2ep) 和 NeuNAc 醛缩酶 (NanA) 提供了更高的可溶性酶回收率和工艺级生物转化性能。使用杆状病毒感染的 Sf9 细胞，建立了用于顺序和一锅法生物催化的纯化酶和全细胞两种配置。全细胞系统无需蛋白质纯化即可实现直接转化，并在实验室规模一锅法条件下，根据其与标准品 HPLC 保留时间的一致性，将产物鉴定为 NeuNAc，转化率约为 23%。工艺优化确定了悬浮培养、感染、底物浓度和催化剂负载的合适条件，并使用在 3 升生物反应器中生产的细胞进一步评估了该平台。除了简化催化剂制备外，全细胞策略还减少了纯化酶工作流程相关的功能催化剂制备要求。如果全面的技术经济评估超出了本工作的范围，但初步的实验室规模成本估算表明全细胞工作流程的原材料支出较低。总体而言，该平台为酶溶解性、折叠或功能表达限制传统微生物宿主性能的生物催化应用提供了一种概念验证性的补充策略。