《Cellular and Molecular Neurobiology》：Using Brain Organoids to Explore Human Neurobiology
编辑推荐：
神经科学领域面临的主要挑战之一是理解人类大脑如何发育成为一个高度有序且功能整合的器官，因为许多发育过程无法直接在人体中进行研究，且在动物模型中亦未能被完全重现。由人多能干细胞（hPSC）衍生的脑类器官已发展为强大的三维（3D）实验模型，能够重现人类神经发育的关
神经科学领域面临的主要挑战之一是理解人类大脑如何发育成为一个高度有序且功能整合的器官，因为许多发育过程无法直接在人体中进行研究，且在动物模型中亦未能被完全重现。由人多能干细胞（hPSC）衍生的脑类器官已发展为强大的三维（3D）实验模型，能够重现人类神经发育的关键特征，包括区域模式化、细胞多样化和神经环路组装。近期在长期类器官培养、类器官生物工程、血管化、组装体（assembloid）技术、移植、多组学（multi-omics）以及人工智能（AI）等方面的进展，显著拓展了脑类器官在研究人类神经发育、模拟神经系统疾病、支持药物发现和推进治疗开发中的应用。单细胞与空间多组学技术与计算方法的整合，已实现了稳健的分子基准分析（molecular benchmarking）、发育保真度评估以及类器官可重复性评价，从而促进了与人类原代胎儿脑组织的直接比较。然而，当前的类器官系统仍因细胞和组织复杂性不完整、类器官间差异性、有限的血管化、有限的功能成熟度以及不完全的生理整合等因素而受到限制。组织工程、计算生物学和标准化分化方案的持续进步，有望增强脑类器官在基础与转化神经科学以及机制性和转化性研究中的生物学保真度和转化实用性。
引言
理解人类大脑发育始终是神经科学领域的重大挑战之一。人类大脑的发育需要神经干细胞增殖、细胞谱系特化、神经元迁移、突触形成和神经环路组装的精确时空协调。这些过程中的任何细微扰动都可能导致神经发育障碍或神经精神疾病，尽管已历经数十年的深入研究，对其认识仍不完整。动物模型，特别是啮齿类动物，为神经发育提供了基础性见解，但其重现人类大脑发育的能力受限于解剖学、细胞学和分子层面的差异。人类大脑皮层在尺寸、细胞构筑和细胞复杂性方面与啮齿类存在显著差异。小鼠大脑为无脑回型（lissencephalic），而人类大脑皮层为有脑回型（gyrencephalic），且包含数量远为庞大的皮层神经元。这种扩张归因于若干人类特异的发育特征，如外侧脑室下区（oSVZ）中丰富的外侧放射状胶质（oRG）细胞，以及灵长类皮层发育中特异的基因调控程序。此外，伦理和实际操作的限制亦制约了对人脑发育的直接研究，这些局限性推动了人类特异性互补实验模型的发展。
脑类器官的概念基础
人类大脑发育按照精确协调的时空事件序列进行，调控神经干细胞增殖、细胞谱系特化、神经元迁移和环路形成。这些过程受动态基因调控网络（gene regulatory networks）的调控，后者与形态发生素梯度、力学信号和细胞间信号相互作用，建立区域性大脑身份并最终生成皮层复杂的细胞构筑。这些发育原理为旨在重现人类大脑发育的脑类器官技术提供了概念基础。神经发生始于脑室区（VZ），神经上皮细胞分化为放射状胶质（RG）祖细胞，即发育中皮层的主要神经干细胞。随着皮层生成的推进，RG细胞由对称分裂转变为不对称分裂，产生一个自我更新的RG细胞和一个神经元或中间祖细胞（IP）。随着皮层发育的持续，增殖活动逐渐转移至脑室下区（SVZ），使其成为妊娠中期的主要生发位点。SVZ包含两类主要祖细胞群：扩大神经元产生的中间祖细胞，以及具有广泛自我更新能力的外侧放射状胶质（oRG）细胞，后者是灵长类皮层生成的标志性特征。与啮齿类大脑不同，人类大脑中的oRG细胞在外侧脑室下区（oSVZ）显著富集，促进人类大脑皮层进化性扩张和复杂性增加，并参与上层皮层神经元的产生。脑类器官技术利用这种内在的自组织能力，通过激活内在基因调控程序驱动区域模式化、祖细胞多样化、神经元成熟和早期组织形态发生。
模拟人类特异性神经发育
脑类器官已彻底改变了人类神经发育研究，使研究人员能够探究在人类胚胎中无法直接获取的发育过程。相较于传统动物模型，类器官能更忠实地重现人类形态发生过程，并能在确定条件下实现精确的基因操作和环境及实验变量的控制。脑类器官重现了祖细胞发育的关键特征，包括外侧放射状胶质细胞的生成、神经元谱系的序贯产生以及人类发育中皮层延长的神经发生周期。单细胞转录组学、表观基因组学和空间多组学的最新进展显著增强了脑类器官的生物学相关性。现代类器官方案与人类原代胎儿脑组织的比较分析表明，其能忠实地重现妊娠前半期发育过程、谱系特化和转录轨迹所依赖的多种基因调控网络。脑类器官越来越多地重现人类神经发育过程，但仍面临重要限制：神经元成熟不完整、胶质细胞多样性和成熟度有限、缺乏功能性血管和免疫组分，以及长程神经连接有限。
超越早期发育：整合复杂性
尽管早期脑类器官主要模拟人类神经发育的早期阶段，培养系统和生物工程技术的进步已使研究人员能够生成具有显著更高结构和功能复杂性的类器官。延长的长期培养是一项重大进展，使类器官能够超越早期神经发生，展示日益复杂的细胞构筑、表现出自发电生理活动的成熟神经元群体以及功能性神经网络。在细胞多样化和功能成熟方面，延长培养促进了日益多样化的细胞群体的出现，包括兴奋性神经元、抑制性中间神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞，有时还包括小胶质细胞样细胞。单细胞转录组学和多模态空间组学研究表明，无论是引导性还是非引导性分化方案，均能重现人类皮层生成过程中发育的众多神经元和胶质细胞群体，同时在晚期神经元成熟、胶质细胞多样化和神经血管发育方面仍存在限制。在构建日益生理化的脑类器官方面，生物工程的进展使脑类器官模型在生理学上日益相关。先进的培养方法——如旋转生物反应器、轨道摇床、气液界面系统和优化的氧合策略——已使促进类器官成熟更为成功，减少了中心坏死并改善了神经元存活。生物工程方法已开始解决类器官系统中的一个关键生物学障碍：功能性血管网络的缺失。内皮细胞共培养、微流控灌注、类器官芯片（organoid-on-chip）系统以及内皮分化的遗传诱导等技术已展示出促进部分血管化和增强组织活力的能力。
生物学限制
尽管脑类器官的发展取得了重大进展，当前的类器官系统尚未完全重现人类大脑。长期培养的类器官虽展示出更高的细胞复杂性和功能，但仍表现出不成熟的迹象，包括神经元成熟不完整、血管化有限、髓鞘形成不完全、神经免疫复杂性有限以及长程神经连接受限。此外，方案依赖性的差异以及干细胞类型的差异导致了实验室间的差异性，限制了跨研究比较。这些限制在解读实验结果时尤为重要。
脑组装体：模拟区域间通讯与神经环路组装
传统脑类器官虽显著推进了对人类神经发育的认知，但区域特异性类器官仅能孤立地模拟单个脑区，无法重现发育过程中解剖学和功能上不同脑区之间复杂的相互作用。为克服传统类器官的局限性，研究人员提出了脑组装体（brain assembloid）的概念，通过融合独立模式化的区域特异性类器官来重现大脑发育的主要过程。随后的进展实现了不同脑区类器官的融合，使研究人员能够研究区域间通讯、神经元迁移和轴突投射等过程。脑组装体为研究人脑中此前难以直接获取的发育过程提供了前所未有的机遇。在疾病建模和转化应用方面，模拟不同脑区功能性通讯的能力已显著拓展了组装体在多种神经和神经精神疾病中的应用。研究者在自闭症谱系障碍和精神分裂症中观察到异常的中间神经元迁移和皮层环路，而皮层-纹状体和中脑组装体模型则促进了帕金森病（PD）中基底节环路的研究。尽管脑组装体具有显著优势，但仍受制于传统类器官系统的许多限制，包括融合效率差异导致的批间变异性增加、神经元成熟不完整以及血管化和代谢支持有限。
类器官移植：连接体外与体内生物学的桥梁
人类脑类器官向动物模型的移植代表了近期最重要的进展之一，其将类器官系统的实验可控性与活体大脑的生理复杂性结合起来。最早期的移植研究表明，植入宿主大脑的脑类器官可长期存活，并通过宿主血管浸润实现进行性的宿主来源血管化。血管化过程显著改善了细胞氧和营养输送，减少坏死，并促进长期神经元存活。移植不仅增强了生理成熟度，还证明人类类器官能够在结构和功能上整合到宿主神经环路中。植入后，类器官向宿主大脑各处延伸长程轴突投射，并接受宿主神经元的突触输入。在疾病建模和再生神经科学的应用方面，患者来源类器官与体内移植的结合为在生物学相关条件下研究神经系统疾病提供了强大的实验系统。尽管取得这些进展，当前脑类器官技术仍存在若干重要的生物学和技术限制，包括功能性整合在各实验间差异显著、细胞构筑组织仍不完整，以及人类与啮齿类宿主环境之间的内在差异可能影响对实验结果的解读。
调控大脑发育的信号因子及其在类器官中的应用
脑类器官技术的一大优势在于其利用了许多调控人类胚胎大脑发育的保守发育信号通路，对这些通路进行精确的时空调控使研究人员能够在体外实现可重复的区域特化、组织模式化、祖细胞增殖和神经元成熟。转化生长因子-β（TGF-β）信号在胚胎发育中对中内胚层特化至关重要，然而大多数类器官分化方案通过药理学抑制（如使用SB431542）来抑制TGF-β信号。骨形态发生蛋白（BMP）信号促进非神经外胚层特化并参与背侧神经管和内侧 pallium 的特化，在类器官发育早期通常被抑制以促进神经外胚层分化。WNT信号调控胚胎发育的多个方面，在体外受到严密调控：早期抑制WNT信号促进前脑特化，而在分化后期激活WNT信号则促进神经上皮扩展和深层皮层神经元的形成。成纤维细胞生长因子（FGF）信号调控中胚层诱导、端脑模式化和中脑-后脑边界的建立，其中FGF2在类器官中被广泛用于维持干细胞多能性和驱动神经祖细胞持续增殖。Sonic Hedgehog（SHH）信号在神经管特化中发挥重要作用，SHH激动剂被广泛用于诱导腹侧前脑身份。视黄酸（RA）信号激活神经管尾部区域并促进祖细胞和神经细胞发育。细胞外基质（ECM）因子影响祖细胞生长、细胞形态和运动以及体内分化。
疾病建模与治疗应用
脑类器官已被公认为研究神经系统和神经精神疾病的有效人类平台。在阿尔茨海默病（AD）研究中，早期里程碑式研究利用表达β-淀粉样前体蛋白（APP）或早老素-1（PSEN1）家族性AD相关变体的三维培养系统，成功实现了细胞外β-淀粉样斑块和磷酸化tau蛋白细胞内聚集体的同时重现。最近，利用患者来源诱导多能干细胞（iPSC）构建的皮层类器官生成了稳健的β-淀粉样斑块，且疾病相关表型可被β-分泌酶（BACE1）或γ-分泌酶抑制剂所改善。在帕金森病（PD）研究中，LRRK2突变被引入中脑类器官，导致多巴胺能神经元标志物表达减少，与多巴胺能神经变性及α-突触核蛋白磷酸化S129形式与内体的共定位一致。在运动神经元疾病方面，研究人员开发了微流控平台以从富集脊髓运动神经元前体的神经球生成定向轴突束，后续研究应用新近发展的分化方案模拟脊髓性肌萎缩症（SMA）。在精神疾病领域中，患者来源脑类器官显示神经元成熟延迟和FGFR1核信号异常，16p13.11微重复研究则揭示了皮层厚度减小与类器官体积变小及祖细胞分裂模式改变之间的相关性。
新兴技术与未来前沿
高通量多组学的突破已转变了脑类器官研究，为人类神经发育过程中的细胞和分子机制提供了前所未有的见解。单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学、单细胞ATAC测序（scATAC-seq）、染色质可及性分析、蛋白质组学和代谢组学等先进方法已被用于生成脑类器官发育的全面分子图谱。在类器官保真度基准分析方面，定量基准策略的建立代表了近期最重大的进展之一，使研究人员能客观评估脑类器官相对于发育中人脑的保真度。人工智能（AI）已迅速成为脑类器官研究中最具变革性的计算技术之一，使研究人员能够探索超越传统统计方法的高维生物学数据集。基于AI的图像分析极大地促进了脑类器官的定量研究，能够对类器官结构、组织构筑和轴突组织进行大规模评估。
计算整合与现存挑战
尽管多组学技术和AI带来了显著进步，若干计算挑战仍制约着脑类器官研究充分发挥潜力。来自不同实验室的多组学数据集存在显著差异性，使直接的跨研究比较面临困难。此外，将转录组学、表观基因组学、蛋白质组学、代谢组学、成像和电生理学数据集整合到统一生物学框架中仍是一项重大计算挑战。
局限性与伦理考量
尽管神经类器官已在体外神经科学中广泛应用，它们代表的是生物学保真度与实验抽象化之间的平衡。分化流程的差异性、成熟不完全、细胞多样性有限以及功能性血管化的缺失等因素均可能影响细胞组成、转录状态、神经元电生理参数及治疗反应。随着类器官系统复杂性不断增加，尤其是那些能够展示更高级神经功能的系统，围绕潜在感知阈值、伤害感受意识乃至基本感觉处理的伦理问题需持续审视。
结论
在过去十年中，脑类器官已逐渐从概念验证技术转变为一个多功能实验平台，用于探究人类大脑的发育原理。该领域正处于一个拐点：类器官已不再局限于简化的发育模型，而正成为评估和探索人类神经元发育、可塑性和疾病机制的工具。未来，血管化、免疫细胞参与、长期发育、标准化分化方案和计算验证等方面的进步有望增强脑类器官的可重复性和转化意义。
