《Aquaculture International》：Dynamics of infectious salmon anemia virus in biofouling on well-boat hulls
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传染性鲑鱼贫血病毒（Infectious Salmon Anemia Virus, ISAV）是全球水产养殖业中的重要病原体，对鱼类健康构成严重威胁，并给生产者造成重大经济损失。因此，了解潜在的传播途径并实施策略以减少生产场所之间的感染传播至关重要。本研究调查
传染性鲑鱼贫血病毒（Infectious Salmon Anemia Virus, ISAV）是全球水产养殖业中的重要病原体，对鱼类健康构成严重威胁，并给生产者造成重大经济损失。因此，了解潜在的传播途径并实施策略以减少生产场所之间的感染传播至关重要。本研究调查了在从ISAV感染场所进行鱼类转运过程中，活鱼船（wellboat）内部表面生物膜（biofilm）和外部船体生物污损（biofouling）中ISAV RNA的动态变化。在运输过程的六个定义阶段进行了采样，包括清洁、消毒和休渔期（fallowing）之前及之后。结果显示，在活鱼船内部生物膜和外部生物污损中均检测到ISAV RNA的存在。病毒载量在运输过程中的鱼类黏膜样本中最高，在外部船体生物污损、内部表面生物膜和水样中检测到较低但可检出的水平。彻底的清洁、消毒和48小时休渔期后，在测试表面上未检测到ISAV RNA。然而，尽管这些程序在场所内所有鱼类转运完成后常规执行，但在通常需要的多次运送航次之间并不实施。研究结果强调了外部船体生物污损作为ISAV颗粒潜在储库（reservoir）的作用，并凸显了严格生物安全规程在预防水产养殖病原传播中的重要性。然而，由于本研究检测的是ISAV RNA而非活病毒，未来工作需要确认船体生物污损中检测到的病毒RNA是否代表具有传播能力的感染性颗粒。
**传染性鲑鱼贫血病毒在活鱼船生物污损中的传播动态：对水产养殖生物安全的启示**
**一、研究背景与问题的提出**
传染性鲑鱼贫血症（Infectious Salmon Anemia, ISA）是一种导致养殖大西洋鲑（*Salmo salar*）高死亡率的重大疾病，其病原体为传染性鲑鱼贫血病毒（Infectious Salmon Anemia Virus, ISAV）。该病毒属于正黏病毒科（*Orthomyxoviridae*）鲑鱼病毒属（*Isavirus*），具有分节段的负链RNA基因组，主要影响海水养殖阶段的大西洋鲑。自1984年挪威首次报道以来，ISA疫情已在苏格兰、加拿大、美国和智利等多个鲑鱼养殖区域暴发。ISAV存在两种主要变异型：与临床疫情相关的HPR缺失型（HPRΔ ISAV）和通常被认为非致病性且可能是HPRΔ ISAV祖先形式的HPR0型。该疾病被世界动物卫生组织列为须通报疾病。
ISAV的传播包括垂直传播和水平传播两种途径。垂直传播发生在亲鱼与幼鱼之间；水平传播则涉及受感染水体经洋流移动、接触污染材料以及与受感染野生鲑鱼相互作用等途径。长距离传播主要通过受污染船只运输受感染鱼类实现。活鱼船在挪威鲑鱼养殖业中扮演着关键角色，负责鱼类运输、治疗、分级以及在网箱之间转移鱼类。尽管挪威食品安全局依据欧盟法规对活鱼船实施了包括船舶设计、运输程序和生物安全规程在内的管控措施，ISAV疫情仍然持续暴发，表明对传播途径的进一步研究十分必要。
目前，一个未被法规充分覆盖且研究不足的传播机制是活鱼船船体上的生物污损。与定期清洁的内部生物膜不同，外部生物污损的管理频率较低，可发展为由细菌、藻类、原生动物以及大型生物（如苔藓虫、被囊动物和藤壶）组成的复杂结构。生物膜有助于微生物的持续存在和病原传播，而大型污损生物还会增加航行阻力、燃料消耗和温室气体排放，并带来入侵物种传播的风险。船体上的生物污损可能使ISAV在宿主体外持续存在，并在船舶运营地点之间转运。虽然活鱼船内部的ISAV传播已通过现行操作规程得到一定管控，但外部生物污损作为ISAV储库的作用尚未被探索。基于此，本研究旨在：（1）调查生物污损作为ISAV RNA传播媒介的可能性；（2）探索内部表面生物膜中ISAV RNA的动态变化。
**二、研究设计与方法概述**
研究人员于2023年2月至2024年6月期间，对三个经确诊ISAV感染的鲑鱼养殖场（案例A、B和C）进行了监测。每次鱼类转运包括六个采样阶段：航行前（P1）、装鱼结束时（P2）、航行途中（P3）、在屠宰场卸货后（P4）、清洗消毒后（P5）以及48小时休渔期后（P6）。案例A对活鱼船、养殖场和鱼类进行了全面采样，包括外部船体水线处生物污损、内部井壁/管道/脱气装置生物膜、井水、周围海水以及鱼类的皮肤/鳃/肠道黏膜样本。案例B和C主要监测船体生物污损，在船尾、船中和船首的水线处及3至4米深度进行采样，同时采集宿主鱼（皮肤和鳃黏液）和海水作为参考样本。
样本采集使用拭子（Zymo Research，美国）进行。内部表面生物膜样本覆盖约5×5厘米区域，船体生物污损通过伸缩杆（可达5米）采集。水样采集180毫升海水，现场通过0.22 μm Sterivex?膜过滤器（Merck Millipore?，德国）过滤。RNA提取使用Quick RNA Miniprep Kit（Zymo Research，美国）。RNA样本经qScript cDNA SuperMix（QuantaBio，美国）逆转录为互补DNA（cDNA）后，使用ISAV特异性引物和探针进行RT-qPCR定量（QuantStudio? 5，Thermo Fisher，美国）。所有显示任何RT-qPCR扩增的样本进一步使用数字PCR（dPCR）（Naica?，Stilla Technologies，法国）分析，采用ISA8检测（靶向ISAV第8节段）进行绝对定量，不受HPR状态影响。数据分析设定检测阈值为Ct≤40，仅满足此标准的重复样本被视为真阳性并纳入定量分析。
**三、主要研究结果**
**案例A（第一次运送）：** 在到达感染场所前的P1阶段，所有检测表面（内部生物膜和外部船体生物污损）均为ISAV阴性。P2装鱼阶段，鱼类黏膜样本（皮肤、鳃和肠道黏液）、网箱海水以及船体水线处生物污损均呈阳性。鱼类黏液病毒载量显著高于环境样本，皮肤、鳃和肠道中的ISAV浓度分别为14,239.7±16,978.6 cp/μL RNA、7,965.8±11,363.1 cp/μL RNA和5,037±6,413.3 cp/μL RNA。网箱海水病毒载量为5.74±2.53 cp/μL RNA，船体生物污损为95.44±129.1 cp/μL RNA。P3航行途中，仅在井水中发现一个阳性重复样本（18.3 cp/μL RNA），脱气装置生物膜四个重复中的三个呈阳性（7.8±2.1 cp/μL RNA）。P4卸货后，船体生物污损呈现700.1±503.3 cp/μL RNA的高水平，脱气装置所有四个重复均呈阳性（96.55±86.7 cp/μL RNA）。卸货后进行内部封闭清洗（P4.2），仅井表面一个重复样本呈阳性（1.38 cp/μL RNA）。
**案例A（最后一次运送）：** 在最后一次运送中，仅鱼类黏膜样本在装鱼时（P2）呈阳性，ISAV水平较第一次监测运送有所降低。P4卸货后，船体生物污损（15.6 cp/μL RNA）、脱气装置生物膜（10.4±4.02 cp/μL RNA）、井生物膜（28.7±26.4 cp/μL RNA）和管道生物膜（5.36±5.1 cp/μL RNA）均检测到阳性。经过清洗消毒（P5）和休渔期（P6）后，所有表面均未检测到ISAV RNA。
**案例B：** 在第一次运送的卸货阶段（P4），鱼类皮肤黏液（61.1±35.3 cp/μL RNA）和船体生物污损（3.3 cp/μL RNA）中检测到低水平ISAV。第二次运送中，鱼类皮肤黏液（16,720±8,816.7 cp/μL RNA）和鳃黏液（30,426.6±26,141.7 cp/μL RNA）的ISAV载量较高，而船体生物污损仍处于低水平（28.4 cp/μL RNA）。卸货（P4）和休渔期（P6）后未观察到阳性检出。
**案例C：** 应用Ct≤40检测阈值标准后，在P1至P6的任何采样阶段均未鉴定出ISAV阳性样本。
**四、讨论与结论**
本研究提供了ISAV通过活鱼船内部生物膜和外部生物污损进行潜在转运的初步证据。在从确诊ISAV感染场所进行鱼类转运期间，研究人员在内部表面生物膜和外部船体生物污损中均鉴定出ISAV RNA。ISAV RNA水平在鱼类黏膜样本中最高，但在活鱼船内部表面生物膜、外部船体生物污损、鱼排处海水和活鱼船井水样本中也可检出。生物膜和生物污损日益被认为是水产病原体的潜在储库。本研究中检测到的ISAV RNA水平在生物膜和生物污损中虽显著低于鱼类黏液，但与鱼排或活鱼船井周围水样中的水平相当甚至更高。值得注意的是，水样需要浓缩后才能分析，而生物膜和生物污损样本仅通过简单拭子采集即可检测到病毒RNA，这凸显了生物膜和生物污损在病毒颗粒即使以低浓度存在于水柱中时也能有效截留的能力。
在所有案例中，清洁和消毒有效消除了活鱼船所有内部表面可检测到的ISAV RNA。额外的48小时休渔期后，外部船体未检出阳性样本，但由于采样有限和所检查船舶船体表面积广阔，不能完全排除残留病毒RNA的存在。然而，由于活鱼船在封闭运输条件下运营，清洁、消毒和休渔仅在养殖场所所有连续鱼类转运完成后才要求执行，而非在每次单独航次后执行。尽管这种方法对管理和控制活鱼船内部系统内的病毒载量有效，但反复往返航次可能通过外部生物污损累积性地导致ISAV颗粒向屠宰场或其他目的地转移。
本研究使用灵敏的RT-qPCR和dPCR方法在活鱼船内部生物膜和外部船体生物污损中鉴定出ISAV RNA。然而，一个重要注意事项是病毒RNA的检出并不能确认具有感染性的活病毒颗粒的存在。PCR检测提示潜在传播途径，但未必表示具有感染性。病毒RNA在环境样本中可能以多种形式存在：完整的感染性病毒粒子、结构完整性部分受损的降解颗粒，或缺乏衣壳保护的自由RNA。生物膜的保护效应可截留病毒物质并延长RNA的可检测性，但这一现象与感染性状态无关。此外，病毒RNA在水生环境中的持久性通常超过活病毒，基因组定量未必意味着感染性颗粒的存在。尽管如此，在装载操作后、任何去污程序之前，在表面和生物膜（特别是外部船体）上检测到ISAV RNA，引发了合理的生物安全关注，因为即使检测到的RNA中只有一部分代表感染性物质，具有传播能力的病毒颗粒也可能合理地持续存在于这些受保护的生态位中。
鉴于挪威鲑鱼养殖业涉及187个陆基孵化场、1,266个养成场所和94个屠宰场，由105艘活鱼船和各种服务船只相互连接构成的复杂网络，对ISAV通过活鱼船和其他服务船只传播风险进行更详细评估十分必要。虽然本研究未确认ISAV通过生物污损的主动传播，但船体表面病毒RNA的检出凸显了一个不应忽视的潜在风险。采样方法仅覆盖船体上部3米范围的拭子样本，未针对已知 harboring 最多样化和广泛生物污损群落的"生态位区域"，因此结果可能低估了活鱼船和其他水产养殖船只船体污损相关的ISAV RNA负载。
**研究结论：** ISAV RNA可在活鱼船内部生物膜和外部船体生物污损中持续存在，表明外部生物污损可能作为ISAV颗粒的潜在储库。彻底的清洁、消毒和48小时休渔期可有效消除检测到的ISAV RNA，但这些程序仅在全部鱼类转运完成后执行，而非在多次运送航次之间。研究强调严格生物安全规程对于防止水产养殖病原传播的重要性。然而，由于本研究检测的是ISAV RNA而非活病毒，未来工作需确认船体生物污损中检测到的病毒RNA是否代表具有传播能力的感染性颗粒。
