植物染色体涂染技术的历史回顾与未来展望——寡核苷酸探针驱动的技术革命

《Chromosome Research》：Chromosome painting in plants: history and future perspectives

　　

染色体涂染（Chromosome Painting）技术于近四十年前在哺乳动物物种中建立，并迅速成为染色体鉴定、比较细胞遗传学（Comparative Cytogenetics）和进化基因组分析的有力工具。在全基因组测序时代到来之前，对不同哺乳动物进行的比较染色体涂染（Comparative Chromosome Painting, CCP）为染色体结构、染色体重排和核型进化奠定了大量基础知识。尽管染色体涂染技术于2001年在植物中首次得到验证，但其应用在很大程度上局限于少数植物谱系，直至2015年基于寡核苷酸（Oligonucleotide, oligo）的染色体涂染技术得以开发。在过去十年中，基于寡核苷酸的染色体涂染技术已彻底改变了植物细胞遗传学领域，使许多此前无法实现的研究成为可能。这些研究为不同植物谱系的减数分裂染色体配对、交叉（Crossover）形成、染色体融合、核型稳定性以及染色体进化提供了新的见解。本综述总结了植物染色体涂染技术发展的历史，重点介绍了基于寡核苷酸的染色体涂染技术所促成的重大发现，并讨论了未来的机遇，特别是染色体涂染与三维染色体和基因组生物学的整合。

哺乳动物染色体涂染技术的发展

染色体涂染（Chromosome Painting, CP）方法学建立于近40年前，代表了分子细胞遗传学（Molecular Cytogenetics）的重大突破。在开创性研究中，大量对人类单条染色体具有特异性的λ噬菌体或质粒克隆被混合并标记为荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）探针。所得探针沿靶染色体全长产生均匀的杂交信号，使研究人员能够在有丝分裂中期或间期核中直接观察和鉴定单条染色体。交叉杂交问题通过抑制杂交（Suppression Hybridization）得以解决，即在探针制备过程中加入过量剪切且未标记的人类基因组DNA以封闭染色体间共有的重复序列，从而显著提高了信号质量和染色体特异性。随后，通过流式细胞术（Flow Cytometry）或染色体显微切割（Chromosome Microdissection）分离单条染色体，并利用简并寡核苷酸引物PCR（Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR, DOP-PCR）扩增微量染色体DNA，大大拓展了CP在哺乳动物及非哺乳类脊椎动物（包括鸟类、爬行类和鱼类）中的应用。临床细胞遗传学是最早且最重要的受益者之一，而比较染色体涂染（CCP），又称跨物种染色体涂染或Zoo-FISH，通过直接可视化近缘物种间保守的染色体或染色体片段，在脊椎动物核型进化研究中产生了深远影响。

植物染色体涂染的早期尝试

哺乳动物中获得的显著CP图像及其巨大潜力激励了多个植物实验室将这一方法学引入植物研究。然而，从分选或显微切割的植物染色体开发的探针遇到了主要障碍：它们含有高比例的重复DNA序列，在全基因组范围内产生广泛的交叉杂交信号。Ingo Schubert及其同事在蚕豆（Vicia faba）、欧洲云杉（Picea abies）和小麦（Triticum aestivum）中清楚地证明了这一挑战——三个物种均因富含重复DNA而无法观察到染色体特异性信号。本文作者于1995年在威斯康星大学麦迪逊分校开始相关研究，利用流式细胞术分选水稻（Oryza sativa）和番茄（Solanum lycopersicum）的最大染色体开发FISH探针，但探针在所有染色体上均产生杂交信号。尽管水稻和番茄的基因组远小于前述物种，但经过多次优化DOP-PCR和抑制杂交条件，仍无法克服广泛的交叉杂交问题。基于这些观察，研究人员得出结论：由于大多数植物基因组中重复DNA的压倒性丰度，基于传统探针开发植物CP极为困难。

基于BAC的染色体涂染——植物中的首个实用方案

2001年，Martin Lysak、Ingo Schubert及其同事证明了通过将大量无重复序列的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome, BAC）混合为单一FISH探针，可在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana, 2n=10）中实现染色体涂染。该方法受益于拟南芥基因组的两个关键特征：基因组极小（约125 Mb），因此相对少量的BAC即可覆盖整条染色体；基因组高度常染色质化，大多数重复DNA集中于着丝粒和近着丝粒区域，大多数BAC克隆含极少或不含重复序列。Lysak及其同事随后利用拟南芥BAC涂染探针对大量十字花科（Brassicaceae）物种进行了广泛的比较基因组分析，获得了关于该科基因组动态和核型进化的基础性见解，包括染色体三倍化、递减性非整倍体化、染色体融合与断裂事件以及着丝粒重定位等。该方法后来也被应用于具有相对较小基因组和高常染色质比例的短柄草（Brachypodium distachyon）。

荧光标记寡核苷酸池——植物染色体涂染中未被讲述的故事

大规模平行合成大量寡核苷酸技术在21世纪初成为可能。研究人员Jim Birchler是最早设想将荧光标记寡核苷酸池用作染色体涂染探针的科学家之一。早在2010年，他与NimbleGen公司合作开发了数个玉米染色体特异性寡核苷酸池，这些探针在靶玉米染色体上产生了强烈且高度特异的涂染信号。受此鼓舞，本文作者随后与NimbleGen合作，利用水稻第8号染色体注释外显子中缺乏可检测旁系同源序列的寡核苷酸设计探针，成功获得了高度特异的杂交信号，在二倍体稻属物种中涂染一对染色体，在四倍体野生稻中涂染两对染色体。然而，该技术面临显著的成本限制，合成约10 μg寡核苷酸池的费用高达3,000美元，极大地限制了其可扩展性，因此这些早期探索最终未被发表。

基于PCR的寡核苷酸池——染色体涂染的真正革命

2012年，寡核苷酸池设计的改良成为染色体涂染发展的转折点。在该系统中，每条寡核苷酸的两侧均带有通用引物序列，可进行PCR扩增和后续荧光标记，使微量商业合成寡核苷酸成为可再生FISH探针来源，有效消除了成本障碍。本文作者团队率先以黄瓜（Cucumis sativus）为模型将该策略应用于植物染色体涂染，证明了该方法原则上适用于任何已测序的植物物种，且探针可成功涂染分化时间长达约1,200万年的近缘黄瓜属物种的同源染色体。此外，该团队还开发了寡核苷酸鉴定和探针设计软件包Chorus，后升级为Chorus2，已成为植物寡核苷酸FISH探针设计的广泛使用工具。

基于寡核苷酸的植物染色体涂染的主要应用

自2015年首次报道以来，基于寡核苷酸的染色体涂染已在包括水稻、玉米、大麦和小麦、马铃薯、甘薯、干豆等主要粮食作物，草莓、黄瓜、香蕉、柑橘等园艺作物，杨树、棉花、花生、油棕、甘蔗等经济作物在内的广泛植物物种中得到迅速应用。

染色体鉴定与核型分析：染色体涂染最直接且通用的应用是对单条染色体的高可靠性鉴定。一旦开发完成，染色体涂染探针可在有丝分裂和减数分裂的不同阶段明确鉴定和追踪靶染色体，且不受染色体大小和复杂细胞遗传学背景的影响，这一点在甘蔗（现代栽培品种2n=100-120）这一高度复杂的多倍体和非整倍体物种中得到了最佳体现。此外，条形码涂染探针可在单次FISH实验中鉴定所有染色体。染色体涂染使在广泛植物中建立由单独鉴定染色体组成的真实核型成为可能，为比较和进化研究提供了坚实的细胞遗传学框架。

减数分裂中的染色体配对：基于CP的染色体鉴定可对减数分裂几乎所有阶段的目标染色体进行明确追踪。研究人员利用马铃薯染色体特异性涂染探针分析了六倍体野生种Solanum demissum（2n=6x=72）的减数分裂中期I（Metaphase I, MI）染色体配对，发现93%的花粉母细胞（Pollen Mother Cells, PMCs）呈现专性二价体配对。相比之下，栽培甘薯（Ipomoea batatas）及其野生祖先种I. trifida（6x）的染色体涂染研究明确揭示了超过90%的PMC中存在高频率的六价体和四价体，强烈支持其同源多倍体性质。此外，在种间杂种中，染色体涂染可直接追踪亲本染色体在减数分裂中的行为，评估同源和部分同源染色体的重组潜力。

单倍型特异性染色体涂染：研究人员基于玉米两个自交系B73和Mo17的第10号染色体序列开发了一系列寡核苷酸池。研究发现，由与对应基因型序列相差至少3-4个单核苷酸多态性（Single-Nucleotide Polymorphisms, SNP）的寡核苷酸组成的探针可作为单倍型特异性涂染探针，在同一细胞中差异可视化两条同源染色体。利用这些探针，研究人员直接观察了B73×Mo17杂种F₂群体中重组第10号染色体上的减数分裂交叉（Crossover, CO），揭示了CO沿整条染色体的分布以及跨越着丝粒的重组抑制域大小。此外，通过在多倍体玉米植株中的实验，研究人员证明同源染色体配对优先发生在序列相似性最高的伙伴之间，表明在新形成的异源多倍体中存在先天的同源染色体配对偏好性。

比较染色体涂染揭示的染色体进化：CCP可在染色体水平直接可视化探针源物种与目标物种之间保守的共线性染色体片段或整条染色体。寡核苷酸探针的成功跨物种涂染取决于源基因组与目标基因组之间的DNA序列分化程度。近期研究显示，来自柑橘模式物种Citrus maxima的涂染探针成功标记了分化超过5,000万年的Boenninghausenia albiflora染色体。CCP研究还揭示木本植物具有异常稳定的核型：杨属（Populus）5个分化约1,400万年的物种中未检测到任何染色体间结构重排；芸香科（Rutaceae）柑橘亚科（Aurantioideae）13个木本物种尽管经历了约2,000万年的分化，仍保留了完整的染色体共线性和高度相似的核型，研究人员推测木本植物的分子钟和染色体钟均运行较慢。

染色体融合的机制与基因组后果：在甘蔗复合群（Saccharum complex）的Narenga porphyrocoma和Erianthus rockii（2n=4x=30）中，一个亚基因组仅含5条染色体，每条均由两条祖先染色体融合而成。高分辨率区域涂染（High-Resolution Regional Painting, HRP）分析表明融合断点始终位于祖先着丝粒附近的近端区域，所有融合染色体均可通过着丝粒错分裂（Centromere Misdivision）后染色体片段重接的模型得到最简约的解释。每次融合事件均伴随着两个祖先着丝粒之一的失活，功能性着丝粒始终来自更靠近新形成融合染色体中心的祖先着丝粒。

染色体易位在进化中的罕见固定：尽管杂合状态下的相互易位（Reciprocal Translocation）因减数分裂中相邻分离产生近50%的不平衡配子而导致半不育，CCP研究和基因组测序分析仍揭示了一些在植物进化中被固定的易位事件。例如，马铃薯和番茄分化约730万年后保持了所有12对染色体的强共线性，但与马铃薯-番茄谱系分化约830万年的Solanum etuberosum在染色体2和7之间发生了相互易位。在哺乳动物中也存在相似模式：人类与黑猩猩之间无相互易位，而分化更久的大猩猩则含有多处相对人类的相互易位。这些发现提出了一个基本的进化问题：最初带来显著适合度代价的染色体重排如何在种群中扩散并最终固定。

未来展望

在过去十年中，基于寡核苷酸的染色体涂染已演变为研究植物染色体生物学的强大平台。染色体鉴定和核型分析在近期可能仍将是染色体涂染最广泛的应用。然而，最具前景的未来方向或许是染色体涂染与三维（Three-Dimensional, 3D）染色体和基因组生物学的整合。寡核苷酸基染色体涂染已被用于可视化间期核中的染色体疆域（Chromosome Territories）和单条染色体的空间组织。同时，染色体构象捕获技术（3C及其衍生物，特别是Hi-C）通过揭示染色质互作模式、染色质区室、拓扑关联结构域（Topologically Associating Domains, TADs）和染色体疆域，彻底改变了人们对高阶基因组组织的理解。这两种方法提供的信息具有根本上的互补性：Hi-C数据可从大量细胞或染色体群体中推断染色质结构，而寡核苷酸基3D染色体涂染可直接在单个细胞核中可视化染色体构象，从而在单细胞分辨率下表征染色体组织并揭示细胞类型、组织、发育阶段和环境条件间的异质性。因此，植物中的寡核苷酸基染色体涂染将继续从一种染色体鉴定技术演变为研究染色体和基因组生物学的重要工具。