拉曼光谱技术在葡萄原生质体制备过程中监测细胞壁去除的新型应用

《Frontiers in Plant Science》：A novel application of Raman spectroscopy to monitor cell wall removal during protoplasting in grapevine

　　

摘要专业翻译 引言： 葡萄（Vitis vinifera L.）是全球栽培最广泛且经济价值最高的多年生果树作物之一。然而，其遗传改良受到漫长的童期以及体外再生和生物技术应用中高度顽拗性的严重制约。近年来，基于原生质体平台的无DNA基因组编辑技术在葡萄中已被证明具有可行性。然而，该方法的成功应用需要对复杂的、基因型依赖的流程进行优化，包括组织培养建立、原生质体分离、细胞再生及全植株恢复等环节。 方法： 本研究探索了拉曼光谱（Raman spectroscopy，RS）作为一种非侵入性、无标记的方法，用于监测两个葡萄品种——西拉（cv. Syrah）和无核白（cv. Thompson Seedless）——原生质体分离过程中细胞壁的降解情况。基于RS的评估被整合到原生质体到植株的工作流程中，并通过原生质体培养和全植株再生进行了后续验证。 结果： 在两个品种中，RS均揭示了胚性愈伤组织中存在的特异性纤维素、木葡聚糖和木质素相关光谱特征，而这些特征在酶解消化后的分离原生质体中消失或减弱。这些光谱变化得到了荧光增白剂28（Fluorescent Brightener 28）染色和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导的GFP转染成功的支持，证实细胞壁降解在功能上足以实现外源物质递送及下游应用。分离的原生质体保持了发育能力，两个品种均通过体细胞胚胎发生和全植株再生得到了验证。 讨论： 这些发现表明，RS为监测葡萄原生质体制备过程提供了一种标准化的、无标记的质量控制步骤，且不损害细胞完整性。通过在酶解消化前后提供详细的分子谱分析，RS能够客观验证细胞壁去除效果。成功的植株再生作为生物学下游验证，证实经RS证实细胞壁消化的分离原生质体保留了发育能力和全能性。将RS整合到原生质体工作流程中，可提高下游生物技术应用（包括顽拗木本物种中的无DNA基因组编辑）的可重复性和效率。

论文解读

一、研究背景与意义

葡萄（Vitis vinifera L.）是全球经济价值最高的多年生果树作物之一，其浆果品质及葡萄酒相关产品的质量与多酚、有机酸、氨基酸、挥发性物质及多糖等代谢物的精细平衡密切相关。然而，葡萄的遗传改良长期面临两大瓶颈：一是漫长的童期延长了育种周期；二是该物种在体外再生和生物技术应用中表现出高度顽拗性，严重制约了转基因和基因编辑技术的应用效率。

近年来，基于原生质体的无DNA基因组编辑平台为葡萄遗传改良开辟了新途径。原生质体是去除全部或部分细胞壁的裸露植物细胞，其缺乏细胞壁的特性有利于外源基因导入并避免嵌合体产生。欧盟2026/1388号法规将无转基因编辑植物（NGT-1类）与传统育种品种同等对待，显著降低了商业化障碍，进一步凸显了该技术路线的应用前景。然而，原生质体平台在葡萄等顽拗植物中的效率仍受多重因素限制，其中细胞壁酶解消化的彻底性及后续细胞壁再合成效率是影响转化效率和植株再生能力的关键环节，但这一步骤长期未受到足够重视。

传统的细胞壁去除验证主要依赖荧光染色（如Calcofluor White、荧光增白剂28）结合显微观察，该方法存在视觉假象和操作者主观性等固有局限。因此，建立一种客观、非侵入性、无标记的细胞壁降解监测方法，对于原生质体流程的标准化和质量控制具有重要价值。拉曼光谱（RS）作为一种基于分子振动指纹的分析技术，已在人体组织、细胞及植物细胞壁研究中展现出强大潜力，但此前尚未被应用于葡萄原生质体制备的质量监控。

二、研究内容与主要结论

研究人员首次将拉曼光谱技术应用于葡萄原生质体分离过程中细胞壁去除的监测，建立了RS辅助的原生质体到植株的完整工作流程。研究选用两个经济上重要的葡萄品种——西拉（cv. Syrah）和无核白（cv. Thompson Seedless）作为材料，通过胚性愈伤组织诱导、原生质体分离、RS光谱分析、PEG介导转染、原生质体培养及全植株再生等环节，系统验证了RS作为质量控制工具的有效性和可靠性。

研究得出以下核心结论：RS能够特异性地检测到胚性愈伤组织中纤维素、木葡聚糖和木质素相关的光谱特征，这些特征在酶解消化后的原生质体中消失或显著减弱；RS监测结果与荧光增白剂28染色结果一致，并经PEG介导的GFP转染成功得到功能验证；RS确认细胞壁去除的原生质体保持了完整的发育能力和全能性，两个品种均成功实现了体细胞胚胎发生和全植株再生。该研究首次确立了RS作为葡萄原生质体制备过程中标准化、无标记质量控制步骤的可行性，为优化顽拗木本物种的原生质体平台提供了客观的分子水平验证手段。

三、主要关键技术方法

研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：

胚性愈伤组织诱导与原生质体分离： 无核白品种的胚性愈伤组织诱导自体外试管苗的未展开幼叶，西拉品种则诱导自果枝花序的花药（带完整花丝的雄蕊）。原生质体从继代培养7–10天的胚性愈伤组织中经酶解消化6小时分离获得，通过过滤和洗涤纯化。

拉曼光谱分析： 采用DXR2拉曼显微镜（Thermo Fisher Scientific），配备50×物镜（NA=0.5）、785 nm红外激光二极管（15 mW功率）、830 lines/mm光栅，光谱范围200–1,800 cm?1，分辨率3.0–4.1 cm?1，曝光时间120秒，8次累积。每个基因型的胚性愈伤组织和原生质体各随机采集10个光谱。

荧光染色验证： 采用2 μM荧光增白剂28（Fluorescent Brightener 28）检测细胞壁消化效率，0.1 mg/mL荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate，FDA）检测原生质体活力，通过共聚焦显微镜和荧光显微镜观察。

PEG介导转染： 以10?原生质体/mL浓度，使用携带GFP标记基因的pEGB3Ω2-35S::GFP::Tnos载体进行聚乙二醇（PEG）介导转染，空载体作为阴性对照，转染后24、48、72小时评估效率。

原生质体培养与植株再生： 采用盘培养法，设置10?、5×10?和10?原生质体/mL三种铺板密度，经体细胞胚胎发生、胚萌发、芽诱导（评估C2D、C2D+4B、MG1、MG1+10B四种培养基）和生根（MSN或RIM培养基）等步骤实现全植株再生，最终移栽至温室。

四、研究结果

胚性愈伤组织诱导： 无核白品种从体外植株的未展开叶片成功诱导出胚性愈伤组织，西拉品种从果枝植株的花药成功诱导。约10周后，外植体产生两种类型的愈伤组织，即奶油色胚性愈伤组织和深棕色非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织转移至C1?培养基长期维持。

原生质体分离效率： 酶解1.5小时后原生质体开始出现，但仍有大量未消化细胞团；3小时后数量增加但多数未呈典型圆形；4.5小时后消化完全。荧光增白剂28染色显示两个品种原生质体的细胞壁均完全消化，仅少数情况可见小碎片。FDA染色显示两个基因型原生质体活力均达平均85%。无核白和西拉胚性愈伤组织的原生质体产量分别为2.1×10?和6.9×10?细胞/g。

拉曼光谱分析： 在700–1,800 cm?1光谱区域，愈伤组织和原生质体光谱总体共享多个特征峰，但相对强度存在明显差异。纤维素相关诊断谱带（约1,090、1,155和1,415 cm?1）在原生质体光谱中消失或显著减弱，表明酶解消化去除了纤维素。木葡聚糖指纹谱带（780和1,480 cm?1）中，1,480 cm?1谱带在原生质体中较胚性愈伤组织降低；890 cm?1强谱带中木葡聚糖信号被果胶信号覆盖。果胶相关信号（890和1,455 cm?1）在消化后仍保留，1,455 cm?1谱带与低甲酯化果胶分子相关，可能反映酶解过程中释放的可溶性片段或残留壁组分。木质素相关谱带（1,272 cm?1芳基-O酚醚伸缩耦合甲氧基C-O伸缩，1,477 cm?1甲氧基不对称弯曲）在胚性愈伤组织中清晰可辨，而在原生质体中显著减弱。此外，1,000–1,500 cm?1区域存在淀粉与纤维素的叠加贡献。

瞬时基因表达分析： 两个品种的原生质体经PEG介导转染GFP载体后，转染后24小时即出现GFP信号，证实RS监测到的细胞壁去除程度在功能上足以实现PEG介导的外源物质递送。空载体阴性对照未检测到GFP信号。

原生质体培养与植株再生： 两个品种的再生时间进程相似：分离后约2周出现第一次细胞分裂，4周形成微菌落，第6–7周出现球形和心形期胚，约3个月后形成成熟子叶期胚。10?原生质体/mL浓度对两个品种均为最有效的铺板密度，获得最多的成熟子叶期胚。西拉品种在各浓度下的成熟胚数约为无核白的两倍，差异显著。西拉品种胚萌发率在各浓度下均显著高于无核白。在芽诱导培养基评估中，除无核白10?原生质体/mL条件外，MG1+10B培养基在两个品种各浓度下均获得最多再生芽。所有芽均成功发育为具有展开叶片和根系的完整植株。西拉品种在10?和5×10?原生质体/mL条件下的再生植株数显著高于无核白，10?条件下无显著差异。两个品种在三种浓度间的植株再生效率无显著差异。移栽至温室后，两个品种均表现正常生长和形态。

五、讨论与结论

讨论部分总结： 研究人员指出，原生质体平台已成为植物生理、生化和分子研究的重要工具，尤其在无DNA基因组编辑生产NGT-1植物方面具有广阔前景。然而，原生质体制备质量、基因型依赖性顽拗性及全植株再生过程的复杂性仍是限制效率的主要因素。细胞壁酶解消化是原生质体系统中的关键步骤，残留的细胞壁组分可能对后续转化效率和植株再生产生负面影响。传统荧光染色方法存在视觉假象和操作者主观性局限，而RS提供了客观、无标记的分子水平验证手段。本研究中，RS揭示的纤维素（约1,155和1,415 cm?1）、木葡聚糖（约1,480 cm?1）和木质素（约1,272 cm?1）相关谱带的消失或减弱，与荧光增白剂28染色结果及PEG介导GFP转染成功相互印证，验证了酶解消化过程的有效性。这些谱带可作为葡萄原生质体分离过程中监测细胞壁去除的候选拉曼光谱标记。研究人员还观察到原生质体铺板密度显著影响体细胞胚发育，最低密度（10?原生质体/mL）在两种品种中获得最多成熟且萌发良好的体细胞胚，较高密度可能因营养竞争加剧而降低胚胎发生效率。两个品种间的显著再生能力差异与已有文献报道一致，可能由品种内源特性（如表观遗传性状）和外源因素（如培养基响应差异）共同驱动。RS的非侵入性特征未来还可用于监测原生质体培养早期细胞壁再合成动力学，这是决定细胞分裂、微菌落形成和长期再生能力的关键因素。

结论部分翻译： 总之，本研究确立了RS作为葡萄（Vitis vinifera）原生质体分离过程中一种快速、无标记且非破坏性质量控制工具的地位。通过识别对应于纤维素、木葡聚糖和木质素降解的特异性光谱标记，RS为细胞壁去除提供了客观评估，克服了传统染料染色固有的视觉假象和操作者主观性。RS并非取代常规程序，而是作为上游标准化检查点，而无核白和西拉品种的下游全植株再生证实了经RS监测的原生质体保留了完整的细胞活力、全能性和发育能力。虽然本研究证明了RS在葡萄中的有效性，但将该光谱框架扩展到更多基因型和组织来源是验证其通用性的下一步。未来研究中，应用RS追踪早期培养期间细胞壁再合成动力学，为理解和优化原生质体分裂及微菌落形成提供了有前景的策略。总体而言，将RS整合为客观质量检查可提高工作流程的可靠性和可重复性，支持优化原生质体平台以生成符合NGT-1资格的转基因-free编辑植株。