《Frontiers in Immunology》：An efficient functional screening method for anti ATP hydrolase antibody based on fluorescent probes
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抗体药物作为现代生物医学领域中的重要药物类别之一，已被成功应用于癌症疾病和免疫紊乱等多个领域。在单克隆抗体药物开发的早期阶段，研究人员需要从免疫动物获得的众多候选抗体中准确选择高功能性抗体以供后续开发。然而，由于抗原与抗体之间的结合位点具有多样性，通过传统
抗体药物作为现代生物医学领域中的重要药物类别之一，已被成功应用于癌症疾病和免疫紊乱等多个领域。在单克隆抗体药物开发的早期阶段，研究人员需要从免疫动物获得的众多候选抗体中准确选择高功能性抗体以供后续开发。然而，由于抗原与抗体之间的结合位点具有多样性，通过传统方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹法、表面等离子体共振（SPR）亲和力检测）获得的高评分抗体不能完全代表其对靶蛋白的高封闭功能。这种不确定性延长了研发周期并增加了检测成本。本文以胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶2（ENTPD2）为例，介绍一种获得专利（申请号202511470362.1，中国）的功能水平直接筛选抗体的方法。该筛选方法将ENTPD2酶、底物ATP和抗体按严格剂量比混合，以建立精确的反应条件；反应完成后，检测残余ATP含量以评估抗体对该酶的抑制效果。为确保筛选过程的准确性，研究人员建立了细胞系统和小鼠模型以验证抗体的功能。利用该方法，研究人员初步从214个兔单克隆B细胞上清液中筛选出5种抗体。这5种抗体在细胞系统和小鼠模型中均表现出抑制功能。结果表明，该功能筛选方法具有高准确性、高效率和高通量的特点，可显著缩短研发时间并降低成本。
## 论文解读
### 一、研究背景与问题
ATP分子由腺嘌呤、核糖（五碳糖）和三个磷酸基团组成，在生物体内充当能量交换的通货，在能量产生与消耗过程（如水解和磷酸基团转移）之间发挥核心连接作用。ATP不仅是细胞内的能量载体，还作为一种信号分子参与细胞通讯，其降解产物用于基因合成。在细胞内，多种酶利用ATP水解产生的能量驱动重要的生理过程，这些消耗ATP的酶广泛分布于细胞膜、胞质基质、细胞骨架、细胞核和细胞器中，根据其分布位置和功能可分为离子转运ATP酶、细胞骨架相关ATP酶、生物大分子合成与修饰酶、蛋白质折叠与降解酶以及其他重要ATP酶等类别。
研究显示，细胞膜上存在某些ATP水解酶，其异常表达水平与病理状态相关，其中核苷三磷酸二磷酸水解酶（NTPDase）家族备受关注。该家族包含8个亚型，其中ENTPD2（即CD39L1）的活性结构域面向膜外侧。大量研究表明，ENTPD2的表达水平调控与多种疾病状态密切相关。实验研究显示，Entpd2在肿瘤移植小鼠模型中是促进肿瘤生长的主要调控基因之一；在胆管纤维化和硬化过程中，门静脉成纤维细胞的Entpd2表达至关重要；Entpd2基因敲除可导致小鼠味觉反应下降、加剧实验性结肠炎症状、增加肝损伤纤维化程度、加重对乙酰氨基酚诱导的肝毒性。生物信息学分析同样表明，ENTPD2与肝癌、肺腺癌、前列腺癌等多种癌症的不良预后密切相关，是疾病发展过程中的关键调控基因。这些研究结果共同表明，ENTPD2在疾病状态的调控网络中占据重要位置，尤其在肿瘤疾病中，其高表达与肿瘤进展密切相关，且已有实验证明降低该基因表达可有效减缓肿瘤进展，提示ENTPD2靶点具有潜在的临床价值。
在抗体药物开发中，筛选功能性抗体是必不可少的步骤。传统的主流筛选方法以“结合优先”为核心，包括杂交瘤技术、噬菌体展示、酵母/哺乳动物细胞展示等，这些方法技术成熟但耗时耗力，且存在一个根本性缺陷：通过传统方法获得的高结合力抗体不一定具有高封闭功能，因为抗原与抗体结合位点的多样性导致部分抗体虽能高效结合抗原却无法有效封闭功能性结构域。这种不确定性延长了研发周期并增加了检测成本。因此，开发一种在功能水平上直接筛选抗体的方法具有重要的实际意义。
### 二、研究目的与意义
针对上述问题，研究人员以ENTPD2为靶点，设计并验证了一种基于荧光探针的功能水平直接抗体筛选方法。该方法的核心理念是“功能优先”，将抗体对靶蛋白的功能封闭作用而非单纯结合能力作为筛选标准，旨在提高抗体筛选的准确性和效率，缩短药物研发周期并降低成本。研究人员建立了生化检测系统、细胞验证系统和动物模型三级验证体系，从214个兔单克隆B细胞上清液中筛选出具有抑制功能的抗体，证明了该方法的可行性和优越性。
### 三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
1. **生化筛选系统**：将ENTPD2酶、底物ATP和待检抗体按严格剂量比混合，利用荧光素酶检测系统定量反应后残余ATP含量，通过专用公式计算抗体对酶的抑制率，实现功能水平的直接定量评估。该系统仅需5-15 μL原始B细胞培养上清液，无需抗体纯化即可完成高通量初筛。样本来源为用ENTPD2蛋白免疫兔后获得的214个B细胞单克隆培养上清液。
2. **细胞验证系统**：构建了ENTPD2过表达和基因敲除的转基因细胞系，包括来源于小鼠黑色素瘤的B16F10 hEN OE（过表达人ENTPD2）及B16F10 mEN KO（敲除小鼠Entpd2）细胞对，以及来源于人胚胎肾的HEK293 hEN OE及野生型HEK293细胞对，用于验证抗体在细胞膜表面环境中的抑制功能。
3. **小鼠肿瘤模型**：将B16F10 hEN OE细胞皮下接种至免疫健全的C57BL/6J小鼠，建立同基因移植瘤模型，以专利抗体mAb1为阳性对照，评估候选抗体在体内的肿瘤抑制功能。
### 四、研究结果
**生化系统的检测窗口与抗体筛选结果**
研究人员利用荧光素酶消耗ATP催化底物荧光素产生荧光的原理建立检测体系。ATP-only组未经水解反应，ATP含量最高，荧光强度最大；ENTPD2+ATP组的ATP被酶水解，荧光强度降低，两组间的荧光差异构成检测窗口。阳性抗体mAb1组的抑制率为84.7%，落在检测窗口内；阴性抗体mAb13组的抑制率为-0.25%，可视为0%。该结果表明此生化检测系统具备可靠的专一性。利用该系统，研究人员从214个候选单克隆细胞上清液中初筛出30余个具有良好抑制功能的抗体，经多轮复筛，综合考虑不同抗体在储存条件下的功能衰退因素，最终选取5个抗体（7B12、11A2、12G4、13A4、16F8）进行大规模表达和纯化。
**细胞系统的检测窗口与抗体验证结果**
以ENTPD2阴性细胞组（KO+ATP）和ENTPD2阳性细胞组（OE+ATP）的荧光强度作为检测窗口的两个端点，对应抑制率分别为100%和0%，抗体组的抑制率居于两者之间。选择ENTPD2阴性细胞组而非ATP-only组作为窗口上限，是因为细胞内存在其他与检测靶点无关却会影响ATP水平的反应。经生化系统筛选获得的抗体大规模表达纯化后，在严格统一剂量条件下于细胞检测系统中表现出预期效果。B16F10 mEN KO与B16F10 hEN OE细胞系统的测试结果与HEK293 WT及HEK293 hEN OE细胞系统一致，证实了细胞系统验证结果的可靠性。
**小鼠肿瘤模型中的抗体功能验证**
为更准确验证抗体功能，研究人员将B16F10 hEN OE细胞皮下接种于C57BL/6J小鼠建立肿瘤模型，以专利抗体mAb1为阳性对照开展体内实验。结果显示，与空白对照组相比，所有候选抗体均表现出抑瘤趋势；与阳性对照mAb1相比，抗体7B12表现出更好的抑制效果。该结果进一步验证了这些抗体的有效性，也证实了该筛选方法的可靠性，说明经生化系统初筛获得的抗体在细胞系统和体内均保持抑制功能。
### 五、讨论部分总结
在讨论部分，研究人员详细阐述了该功能筛选方法的优势和若干关键技术考量。
关于生化检测系统，候选抗体的精确浓度难以确定，且不同抗体对靶抗原的结合能力差异显著，不适合采用依赖抗原-抗体结合的常规检测方法。传统的ELISA、蛋白质印迹、SPR亲和力测定等方法无法区分抗体对功能结构域的封闭能力，导致筛选准确性不足。研究人员的前期数据也证实，亲和力较高的抗体不一定表现出较强的水解活性抑制效果，结合亲和力的排序与抑制功能的排序并不一致。因此，直接从功能角度出发建立检测系统是更合理的策略。生化检测系统无需纯化抗体，显著降低了成本，具有短检测时间、操作便捷、所需抗体量小等优点，适合大规模初筛。
关于温度控制的策略，由于细胞是极其复杂的生命单位，存在大量已知和未知的生化反应，为排除干扰、突出ENTPD2-抗体-ATP之间的相互作用，研究人员采用低温（0°C或4°C）预处理以抑制细胞内的非特异性生化反应，再在37°C短暂反应以突出目标酶的催化活性。在生化系统中，低温可逆地暂停酶催化功能，确保所有样本具有一致的反应时间和强度。研究数据显示，将系统存放于0°C或4°C数小时无显著影响，而25°C下数分钟内即有大量背景信号产生。
关于检测窗口的设置，只有ATP浓度与荧光强度呈线性关系时，抑制率计算公式才有意义。检测窗口需尽可能宽且处于适当的信号强度范围内，这需要通过调节ENTPD2酶的剂量和ATP浓度来实现。若窗口设置不当，会出现大多数抗体抑制率为0%的假阴性现象，或部分抗体抑制率为100%而无法区分功能差异的情况。合理的剂量选择标准是：最佳抗体的计算抑制率落在50%-100%范围内，同时维持ATP在线性范围内。在细胞系统中，还需注意细胞贴壁会产生大量ATP干扰检测，研究人员采用非组织培养处理板并严格控制反应温度和时间来排除干扰。
### 六、研究结论
本研究以ENTPD2为例，报道了一种在功能水平检测抗体封闭其ATP水解能力的方法，该方法主要应用于抗ENTPD2抗体开发进程中，能够准确高效地在功能水平评估抗体的活性。
该筛选方法将ENTPD2酶、底物ATP和抗体按严格剂量比混合以建立精确反应条件，反应结束后通过检测残余ATP含量评估抗体对酶的抑制效果。将该方法用于214个兔单克隆B细胞候选样本的初筛，获得5个在细胞系统和小鼠模型中均表现出抑制功能的抗体。该功能筛选方法具备高准确性、高效率和高通量的特点，可显著缩短抗体药物研发时间并降低成本。该方法不仅适用于抗ENTPD2抗体药物，还可为针对该靶点的小分子化合物抑制剂筛选提供参考，只需将系统中的抗体替换为适当浓度的小分子药物即可。
