# 标题 基于亲和选择质谱筛选技术发现新型COP1结合肽

《RSC Chemical Biology》：Affinity selection mass spectrometry screening discovers new COP1 peptide bindersOpen Access

　　

# 摘要翻译

靶向E3泛素连接酶的化学探针开发仍然是一项重大挑战，尽管这类酶在细胞调控和疾病中发挥着核心作用。组成型光形态建成因子1（COP1，又称RFWD2）是一种E3连接酶，其复杂的、依赖接头蛋白的生物学特性使得其选择性靶向十分困难。在本文中，研究人员开发了一个基于肽的亲和选择质谱（Pep-AS-MS）平台，用于发现新型COP1肽类结合剂。通过利用质谱兼容的文库设计、荧光引导的选择优化以及基于开源软件的靶标-诱饵数据库策略进行肽鉴定和定量，研究人员实现了从高度复杂的组合文库中进行命中排序。利用该方法，研究人员鉴定并验证了六个此前未被报道的COP1结合肽，其中包括结合效力与天然TRIB1基序相当的配体。本工作建立了一个定量且易于获取的Pep-AS-MS框架，用于针对挑战性蛋白质-蛋白质相互作用靶标的配体发现，并为探究COP1生物学提供了新的化学工具。

# 论文解读

## 研究背景与科学问题

蛋白质泛素化修饰调控着诸多重要细胞过程，包括炎症反应、DNA损伤修复、细胞信号传导和蛋白质稳态维持。泛素化由E1–E2–E3酶级联反应介导，其中E3泛素连接酶负责最终的底物泛素化步骤，已被广泛认为是具有药物开发潜力的靶标类型。组成型光形态建成因子1（COP1）是一种在植物和人体中高度保守的E3连接酶，通过调控CCAAT-增强子结合蛋白（C/EBP）转录因子家族等多种底物的稳定性，参与干细胞命运决定、免疫细胞重塑和代谢活动等关键生物学过程。COP1具有多种活性模式，可独立降解底物，也可与TRIB1、TRIB2、DET1和STK40等底物接头蛋白形成复合物发挥功能。无论底物是直接还是间接被招募，COP1的配体结合口袋都至关重要，因为底物和接头蛋白均含有一个保守的缬氨酸–脯氨酸（VP）肽基序与该口袋结合。

COP1在疾病中的多效性和复杂性使得传统的基因敲减/敲除等靶标验证手段难以充分揭示其在各情境下的细微功能差异，导致理性设计COP1靶向治疗策略面临困难。因此，鉴定和开发能直接结合COP1的强效选择性化学探针存在迫切需求。然而，迄今为止针对COP1的配体发现极为稀少且局限于肽类，尚无报道实现直接的COP1靶标结合验证。

肽基亲和选择质谱（Pep-AS-MS）是一种新兴的混合型高通量筛选技术。与噬菌体展示和mRNA展示等展示型混合筛选方法不同，Pep-AS-MS文库成员是自我编码的，降低了命中反卷积的复杂度，并可实现不同的结合取向。此外，该类文库不受20种天然氨基酸的限制，完全通过固相肽合成（SPPS）方法构建，且质谱测序基于电离和分子量，因此是“残基无偏”的。基于上述优势，研究人员利用已有的COP1结合基序知识，建立Pep-AS-MS筛选流程，以发现新型且化学结构多样的COP1肽类化学探针。

## 主要技术方法

研究人员设计并合成了4个不同规模和组成的组合肽库：包含1670万个成员的多样性天然氨基酸文库（文库1）、256成员的二元丙氨酸扫描文库（文库2）、以及各262144成员的VP基序保留文库，其中文库3全部使用天然氨基酸，文库4则混合使用天然和非天然氨基酸。所有文库引入以下MS兼容设计：排除异亮氨酸（与亮氨酸等重）、半胱氨酸（防止SPPS过程中树脂上氧化）、天冬酰胺（防止脱酰胺副产物）和精氨酸（碎片谱质量差）；将剩余天然氨基酸分为两组以增强MS2碎片独特性；C端固定赖氨酸以稳定电离态。文库合成采用“分割–混合–脱保护”方案。

肽鉴定方面，研究人员对比了从头测序（PEAKS Studio 11）和靶标-诱饵数据库搜索（Fragpipe开源软件）两种方法，发现后者在1%假发现率（FDR）下可覆盖文库2中98%的肽，显著优于从头测序的41%，因此采纳数据库搜索策略进行后续分析。

亲和选择优化方面，研究人员合成了C端赖氨酸修饰的TRIB1肽（1）及其N端氨基己基（Ahx）连接的5(6)-羧基荧光素（5(6)-FAM）标记衍生物（2）作为工具化合物。利用荧光作为快速经济的手段，系统优化了His标记COP1蛋白在Ni-NTA磁珠上的固定比例、孵育温度（25 °C优于4 °C）、洗脱方式（80 °C热洗脱10分钟）等关键参数，并确定了进入选择的文库拷贝数至少需达到检测限的400倍以上。确定的最优条件为：每成员100 pmol（文库2）、25 °C孵育1小时、80 °C条件下PBS热洗脱。

结合验证方面，采用表面等离子体共振（SPR）和时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）竞争实验对单独再合成和纯化的命中肽进行体外结合评估。

## 主要研究结果

### 组合肽库的设计与合成评估

文库合成后，研究人员通过质谱分析评估了各文库的鉴定覆盖率、丰度分布和残基频率保真度。文库1仅获得0.01%的鉴定率，反映了超大文库完全分析的挑战；文库2、3、4的鉴定率分别为97.2%、6.75%–10%。丰度分布分析显示文库2、3、4均呈现窄而对称的钟形曲线，表明分割–混合–脱保护方案能产生近似等量的肽混合物。序列标志分析证实除文库1中脯氨酸和天冬氨酸在个别位置略有过度呈现外，各氨基酸均以预期比例出现在设计位置，验证了文库对原始设计的高保真度。

### COP1肽结合剂发现AS-MS工作流程验证

以文库2为基准，在100 pmol每成员的最优拷贝数条件下，超过30个肽在基质对照和COP1固定条件下均被鉴定和定量。靶标对比基质的选择性分析显示，TRIB1（SDQIVPEYK，1）为最强COP1选择性结合肽。有趣的是，谷氨酸位点的单丙氨酸取代（SDQIVPAYK，3）、天冬氨酸位点的单取代（SAQIVPEYK，4）及两者的双取代（SAQIVPAYK，5）紧随其后，提示这两个酸性残基对COP1结合惩罚最小。这与文献报道的常规单丙氨酸扫描结果（酪氨酸最不重要）不一致，说明AS-MS提供的所有可能丙氨酸取代组合的整体扫描可提供新的构效关系（SAR）洞见。研究人员还观察到丙氨酸计数与COP1结合强度之间呈预期的负相关。SPR和TR-FRET验证了这些丙氨酸取代仅对COP1结合产生轻微影响，亲和选择数据与体外结合结果一致，确认了筛选流程的可靠性。

### 更复杂文库的COP1亲和选择

对于文库1，以每成员150 fmol（达到完全水溶性的最大拷贝数）进行选择。在含1000倍过量TRIB1（1）掺入的COP1条件中，TRIB1（1）被富集鉴定为强命中，而提高靶标上样量至20 μg和优化Fragpipe“运行间匹配”参数后，TRIB1（1）仅在COP1负载条件下被鉴定和富集，证实该工作流程可从复杂混合物中检测真实结合剂。

应用Fragpipe命中筛选流程，在文库1中共鉴定出92个命中肽，其中两个（TDQVPVWK，6和VLALYLTPK，7）在生物学重复亲和选择中重现。许多命中肽含有VP基序，与该基序对WD40结构域结合的重要性一致。基于含VP基序和结构多样性选择8个命中进行单独再合成和验证，其中SFALVPVLK（8）通过SPR显示与COP1的特异性结合，VLALYLTPK（7）通过TR-FRET显示与TRIB1（1）相当或更优的抑制效力。肽7因水溶性差而无法准确测定SPR结合常数。这两种最强化合物的计算logP值较TRIB1（1）显著增加（>5个单位），提示脂溶性大幅提高。使用不相关蛋白CSN5固定于参比流道的SPR实验排除了脂溶性增加导致的非特异性结合或聚集效应。

对于文库3（VP聚焦天然氨基酸库），鉴定出4个重现性命中，经TR-FRET验证，其中KTDVPAMVK（11）和KYMVPVMSK（12）显示较弱的竞争性置换活性（IC₅₀ ≈ 50–400 μM）。对于文库4（VP聚焦非天然氨基酸库），仅NEUVPVWEK（13）在两个重复选择中均被检出，但再合成和验证未显示可观的COP1结合。总体六个肽获得验证，确认率达30%（6/17），其中最强化合物来自多样性文库1而非聚焦文库，提示深度化学采样对产生新化学实体至关重要。

## 总结与结论

本研究首次报道了整合开源靶标-诱饵数据库搜索方法（Fragpipe）的合成肽AS-MS工作流程，用于肽结合剂的鉴定和定量。与广泛使用的从头测序方法相比，该策略在中型文库中显著提高了肽鉴定率，并提供了匹配的定量数据，实现了理性命中排序和高效筛选分诊。研究人员还展示了非天然氨基酸在组合9-mer肽库中4个可变位置的替换可获得与全天然氨基酸文库相似的鉴定率。

研究人员建立了包括文库保真度分析、荧光探针优化和靶标依赖性富集实验在内的高质量、低成本且可推广的工作流程。以COP1为模型靶标，发现并验证了六个此前未报道的结合肽，其中部分序列的结合效力与天然TRIB1基序相当，但脂溶性显著提高，虽有利于细胞通透性，但进一步研究（如动态光散射和细胞实验）仍需确认这些肽的聚集倾向和实际细胞渗透能力。

**研究结论：** 本工作建立了一个基于肽的亲和选择质谱（Pep-AS-MS）工作流程，通过将精心设计的文库构建、荧光引导的选择优化和验证过的质谱鉴定方法相结合，证实Pep-AS-MS是制备和筛选聚焦型及高度复杂组合肽库的有力工具。其核心进展在于实现了开源靶标-诱饵数据库搜索策略用于合成肽鉴定和定量，相较从头测序提供了更优的鉴定率和匹配的定量数据。利用该平台，研究人员鉴定并验证了六个COP1结合肽，为在翻译后修饰背景下超越遗传学手段探究COP1生物学提供了有价值的化学工具起点。该定量且易于获取的Pep-AS-MS框架可推广至结构生物学信息有限的挑战性蛋白质-蛋白质相互作用靶标的配体发现。