基于G-四联体结构荧光适配体分析平台的临床样本中Aβ42高灵敏度和高特异性高通量检测方法

《Talanta》：Highly Sensitive and Specific High-Throughput Detection of Aβ42 in Clinical Specimens Using a G-quadruplex-structured Fluorescent Aptamer Analysis Platform

　　

• 1.
  通过序列修剪和优化，开发了一种针对Aβ42的高亲和力G-四链体适配体。
• 2.
  通过硫黄素T介导，实现了0.01–100 pg/mL范围内的线性响应，检测限低至3 fg/mL。
• 3.
  在临床血浆样品中展现了优异的重复性和稳定性。
• 4.
  在阿尔茨海默病诊断中具有敏感、特异、快速且可规模化的Aβ42检测潜力。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种全球性的、不可逆的神经退行性疾病，对老年人的健康和生活质量构成严重威胁。其核心病理特征是大脑中淀粉样蛋白β（Aβ）肽的异常积累，导致老年斑的形成⁽¹⁾、⁽²⁾。在各种Aβ肽中，淀粉样蛋白β42（Aβ42）因其较高的聚集倾向和神经毒性，被广泛认为是老年斑形成的主要贡献者³。因此，亟需开发高灵敏度和高特异性的Aβ42单体定量检测方法，尤其是在疾病早期阶段，以用于AD的诊断、预后评估和治疗方案的监测。

目前，AD的诊断主要依赖于侵入性的脑脊液分析和昂贵的正电子发射断层扫描成像⁴。尽管这些方法被视为"金标准"，但它们的侵入性、高成本和复杂程序使其不适合大规模人群筛查。相比之下，血液由于其易于采集和高重复性，已成为开发新型AD诊断工具的理想来源。然而，血液中的Aβ42浓度极低；此外，肽颗粒以多种聚集形式存在于复杂的血清基质中，并与各种蛋白结合，对传统分析方法构成了重大挑战⁵。例如，酶联免疫吸附测定（ELISA）作为一种常用方法，由于抗体批次间的差异、对Aβ聚集状态的识别不足以及血清蛋白的干扰，往往产生不一致且不可靠的结果⁶。近年来，包括电化学传感器⁷、场效应晶体管（FETs）⁸和表面增强拉曼光谱（SERS）⁹在内的各种先进分析技术已被探索用于灵敏的Aβ检测，展现出卓越的分析灵敏度。因此，开发能够在复杂血液环境中有效工作、同时保持高灵敏度、易于操作和低成本的检测新技术，仍是Aβ检测领域面临的关键挑战。

基于荧光分析方法因其固有的优势——低成本、易于操作和高灵敏度——被视为理想的检测工具⁽¹⁰⁾、⁽¹¹⁾、⁽¹²⁾。然而，传统荧光探针存在光漂白、以及由于非特异性结合和生物样品固有自荧光导致背景信号升高等局限性⁽¹³⁾、⁽¹⁴⁾。这些局限性严重损害了灵敏度和准确性，尤其是在高通量筛选和检测场景中¹⁵。为了应对这一挑战，生物传感领域迫切需要一种能够实现信号控制、同时满足高灵敏度和高通量分析需求的探针¹⁶。适配体的出现为这一挑战提供了革命性的解决方案。适配体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）方法⁽¹⁷⁾、⁽¹⁸⁾在体外筛选的单链DNA或RNA分子，它们能够以高亲和力和高特异性结合多种靶标，因此有时被称为"化学抗体"⁽¹⁹⁾、⁽²⁰⁾。与传统抗体相比，适配体具有可控自动化合成、优异的化学稳定性、低免疫原性和出色的可扩展性等优势，使其成为构建高灵敏度、高通量传感器的理想识别元件⁽²¹⁾、⁽²²⁾。然而，通过传统SELEX方案筛选出的初级适配体序列较长⁽²³⁾、⁽²⁴⁾。这些冗余的末端区域通常引入显著的空间位阻，引发非特异性结合，并限制靶标相互作用时的结构适应性⁽²⁵⁾、⁽²⁶⁾。这些结构缺陷损害了信噪比，限制了在复杂生物基质中的检测灵敏度²⁷。合理的分子修剪提供了一种精确的优化方法，可以去除适配体上的非必要末端核苷酸⁽²⁸⁾、⁽²⁹⁾。这种方法保留了核心识别结构域，同时减少了空间位阻，从而提高了靶标可及性并增强了传感性能⁽³⁰⁾、⁽³¹⁾。

在本研究中，我们引入了一种基于序列修剪G-四链体适配体和硫黄素T（ThT）信号置换的免洗荧光适配体分析平台，用于Aβ42检测。我们通过系统修剪44 bp亲本适配体中冗余的末端碱基，构建了一个29 bp的核心变体（适配体A）。修剪后适配体的结合亲和力、二级结构和分子识别机制通过生物膜干涉仪（BLI）、圆二色谱（CD）光谱和分子动力学（MD）模拟进行了系统评估。靶标结合时，精制的G-四链体结构既作为Aβ42的特异性识别受体，又作为ThT的可切换宿主，通过竞争性置换ThT产生荧光关闭响应。此外，这种均相检测在加标生物基质中的实际应用能力和抗干扰能力进行了系统评估，并通过临床血浆标本进行了验证。临床评估结果表明，该分析平台不仅能够有效区分AD患者和健康对照组，还与传统ELISA结果表现出高度相关性，证明了其优异的准确性和可靠性。综上所述，本研究通过适配体序列裁剪和传感策略优化，成功开发了一种具有高灵敏度和特异性的Aβ42检测平台。鉴于其高通量检测能力和成本效益，该分析方法有望成为大规模早期AD筛查的有力工具，为AD的精准医学和早期干预提供新的见解。

章节摘录

Aβ42单体制备

首先，将六氟异丙醇（HFIP）和Aβ42冻干粉在冰上预冷。然后，将1.0 mL HFIP加入10 mg Aβ42冻干粉中，充分涡旋混匀，制备10 mg/mL Aβ42母液。母液分装后在-20°C保存备用。实验时，直接将10 mg/mL Aβ42母液稀释至所需工作浓度。

Aβ42检测的荧光适配体分析平台

对于Aβ42检测，将29 bp核酸适配体粉末溶解于TE中

高亲和力Aβ42适配体的设计

适配体序列如附表S1所示。基于使用QGRS Mapper生成的预测结果⁽³²⁾、⁽³³⁾（附表S2），我们对44 bp适配体序列进行末端截断和碱基突变，构建了三个适配体变体（A、B和C）（图1A）。对44 bp适配体（亲本适配体）两端进行修剪，得到29 bp截短适配体（适配体A）。44 bp适配体序列如下：CCGGTGGGGGACCAGTACAAAAGTGGGTAGGG

CGGGTTGGAAAA。将TA碱基突变为GG碱基，创建

结论

本研究基于序列修剪的G-四链体和ThT信号置换，开发了一种用于Aβ42检测的免洗荧光适配体分析平台。所获得的29 bp适配体A通过去除亲本44 bp适配体中非必要的末端碱基对，表现出降低的空间位阻和提高的结合亲和力（K_d = 0.814 nM）。分子动力学模拟和实验表征证实了适配体A的结构稳定性及其与Aβ42之间的特异性相互作用。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知竞争性经济利益或个人关系。

CRediT作者贡献声明

许锋：撰写——审阅与编辑、项目管理、概念化。刘思尧：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、概念化。丛伟：项目管理、概念化。胡洪刚：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、概念化。崔蒙：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、资源、方法学、形式分析、数据管理。杨炯：撰写——审阅与编辑、

数据可用性

数据将根据要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本论文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究由国家自然科学基金资助（项目编号：22477075和22077078）。

崔蒙|杨炯|赵锡辰|胡晓春|丛伟|胡洪刚|许锋|刘思尧