《Macromolecular Bioscience》：“Single-Cell Encapsulation of Lactiplantibacillus Plantarum Via Layer-by-Layer Technique for Enhanced Viability and Shelf Life: Insights on Multilayer Assembly on Bacteria”
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益生菌的功效取决于其在胃肠道转运过程中的存活能力；然而，传统制剂在到达肠道之前通常会出现2–3个对数单位的活性损失。本研究报道了利用聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）和海藻酸盐（alginate，Alg）的逐层（layer-by-laye
益生菌的功效取决于其在胃肠道转运过程中的存活能力；然而，传统制剂在到达肠道之前通常会出现2–3个对数单位的活性损失。本研究报道了利用聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）和海藻酸盐（alginate，Alg）的逐层（layer-by-layer，LbL）组装技术，对植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）C8进行单细胞封装，形成保护性双层涂层。通过流式细胞术监测涂层组装过程，并采用石英晶体微天平测量进行验证。流式细胞术揭示首次沉积步骤中聚合物掺入量异常高。透射电子显微镜、原子力显微镜和共聚焦激光扫描显微镜证实了单个细胞周围形成了连续且致密的聚合物涂层。双层涂层在冻干后增强了细菌存活率，同时保持了生长能力，24小时后达到约9.3 log CFU/mg，而未包被细菌及包被四层和六层的细菌分别为8.72、8.84和8.26 log CFU/mg。在模拟胃液条件下，包被细菌表现出比未包被细胞更高的存活率（4.6 ± 0.3 log CFU/mg对3.5 ± 0.2 log CFU/mg）。此外，包被细菌在4°C条件下储存60天后仍保留约5.7 log CFU/mg的活性，储存稳定性延长约10天。
**论文解读：**
**一、研究背景与科学问题**
益生菌是指当摄入足够数量时能够对宿主产生健康益处的活性微生物，已有研究报道其在抗癌、抗过敏、糖尿病防治、冠心病预防、抗衰老及缓解乳糖不耐受等方面的积极作用。植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum，原名Lactobacillus plantarum）因其通过多项临床试验验证的安全性、广泛的生态与代谢适应性，被广泛用于发酵食品和益生菌产品中。然而，益生菌必须穿过胃肠道并在作用部位保持活性才能发挥健康功效。根据FAO-WHO指南，益生菌菌株需在作用部位保持存活。食品配方中通常需要8–9 log CFU/mL的初始过量添加，以抵消加工和胃肠道转运过程中预期的2个对数单位的活性损失。尽管植物乳杆菌被认为对环境胁迫具有相对较高的耐受性，但其活性在食品加工、干燥、储存和胃肠道转运过程中仍会下降，具体取决于菌株和环境条件。
封装技术被研究作为改善益生菌在加工、储存和胃肠道转运过程中存活率的策略。传统封装方法如喷雾干燥、冷冻干燥、挤出法和聚合物微/纳米颗粒形成虽能改善益生菌稳定性，但通常是将细胞群体封装在块状载体基质中。单细胞封装是一种替代方法，将保护材料直接沉积在单个细菌细胞周围，既能保持细胞作为离散生物单元，又可改善保护效果并控制细菌表面与周围环境的相互作用。逐层（LbL）技术通过静电相互作用在细菌表面顺序组装相反电荷的聚电解质，形成纳米尺度可控的聚电解质多层（polyelectrolyte multilayers，PEMs），成为单细胞封装的有力手段。
尽管LbL封装益生菌研究已取得进展，但关于初始聚电解质沉积如何影响后续层的结构和保护性能的关键问题仍未解决。传统LbL体系中通常通过增加层数来逐步提高涂层厚度和功能；然而对于活细菌细胞，过量的聚合物沉积可能干扰细胞生长、分裂或营养物质和代谢产物的交换。因此，确定提供有效保护所需的最少层数，对于理解聚电解质组装与细菌功能之间的关系，以及开发更简单且更具实用性的封装工艺至关重要。
**二、研究目的与主要结论**
该研究提出假设：在具有高抗氧化活性、分离自泰国本地发酵卷心菜的植物乳杆菌C8单细胞上，初始沉积一层PLL和一层Alg即可形成足够致密的保护性涂层，无需多层双层的重复组装即可实现有效保护。研究旨在表征PLL/Alg多层在单个植物乳杆菌C8细胞上的组装过程，确定沉积层数对细菌活力和生长的影响，并评估涂层在冷冻干燥、模拟胃肠道消化和储存条件下的保护性能。研究结果表明，仅两层聚电解质涂层即可形成均匀致密的保护层，显著提高细菌在冻干和模拟肠道条件下的存活率，并延长储存稳定性约10天，为LbL基益生菌递送系统的合理设计提供了简化策略。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：利用逐层（LbL）自组装技术在植物乳杆菌C8表面交替沉积聚-L-赖氨酸（PLL）和海藻酸盐（Alg），构建多层聚电解质涂层；采用Zeta电位测量验证每层沉积后细菌表面电荷的反转；采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）表征涂层形貌与表面结构；利用罗丹明B标记PLL结合流式细胞术追踪单细胞水平的逐层组装动态，并用石英晶体微天平（QCM-D）原位监测多层组装过程。细菌菌株Lactiplantibacillus plantarum C8分离自泰国当地发酵卷心菜，经16S rRNA分析和基因组测序鉴定。
**四、主要研究结果**
**4.1 单细胞封装的Zeta电位验证。** 在pH 6条件下，未包被细菌的Zeta电位为?16 mV，归因于细胞壁中磷壁酸基团的存在。第一层PLL组装后，Zeta电位在150和50 mM NaCl条件下分别反转为+18 mV和+25 mV，证明PLL成功组装。组装带负电的Alg后，Zeta电位再次反转为?20至?30 mV。后续PLL和Alg层交替组装呈现特征性的“之字形”电位变化模式，且绝对值逐渐增大，证实了聚电解质多层膜的成功构建。
**4.2 TEM成像证实涂层形成。** 透射电子显微镜图像显示，未包被的LAB C8具有光滑边缘和清晰的细胞形态。沉积最初两层（PLL/Alg）后，细菌表面出现粗糙化，前景变淡。随着组装层数增加，细菌表面粗糙度持续增大，从形态学上证实了LbL逐层组装的成功进行。
**4.3 AFM表征表面形貌变化。** 原子力显微镜高度图像显示未包被细菌为规则的杆状结构，表面光滑、边界清晰。经过(PLL/Alg)?多层沉积后，细菌轮廓变得模糊，表观厚度增加，PeakForce Error通道显示细胞边缘增强的不均匀对比度，表明形成了连续的聚电解质涂层。横截面分析定量显示了包被后细菌厚度增加和边缘变平滑的变化。
**4.4 CLSM证实均匀包被。** 共聚焦激光扫描显微镜图像显示罗丹明B标记的PLL荧光均匀分布于细菌表面，表明聚合物覆盖均匀。荧光分布局限于细菌外周而非内部，证实涂层仅包裹在细胞表面。补充AFM分析进一步证实仅两层（PLL/Alg）即可在细菌表面形成充分的延伸和保形涂层。
**4.5 流式细胞术揭示单细胞水平的组装过程。** 流式细胞术跟踪显示，第一层罗丹明B标记PLL沉积后细菌荧光强度显著增加（50 mM NaCl下达65 ± 15 AU，150 mM NaCl下达58 ± 15 AU），远高于未包被细菌的0.65 ± 0.06 AU。后续Alg沉积在150 mM NaCl条件下导致荧光下降，而后续PLL沉积使荧光再次增加约10 AU，呈现交替变化趋势。前向散射（FSC）数据显示包被细菌与未包被对照保持相似值，表明组装过程中未发生显著聚集。该结果说明第一层PLL沉积贡献了大部分聚合物质量，归因于细菌糖萼作为软质多孔界面有利于聚合物的渗透和积累。
**4.6 QCM-D在线监测多层组装。** 石英晶体微天平结果显示，细菌固定化后产生显著的频率下降（Δf ≈ ?54.25 Hz）和耗散增加（ΔD ≈ 1.478 × 10??），表明形成了高水合粘弹性细菌层。PLL和Alg的连续沉积产生归一化频率的持续下降，每层PLL注射诱导额外的负频率位移伴随耗散中等增加，而每层Alg沉积也降低频率但伴随耗散相对减少，证实了在细菌模板上形成了可控的多层组装。
**4.7 冻干存活率。** 未包被细菌冻干后存活率为68.25% ± 2.34%，而包被2、4和6层聚电解质的细菌存活率分别为72.55% ± 0.96%、75.13% ± 1.48%和72.72% ± 0.74%，均显著（p < 0.05）高于未包被细菌，表明PLL/Alg涂层能增强冻干后的存活率。
**4.8 生长曲线。** 在滞后期（0–10 h），包被与未包被细菌的活力无差异。在对数期（16–20 h），2、4和6层包被细菌表现出高于未包被细菌的生长速率。在稳定期（22–24 h），2层包被细菌活力最高（24 h时约9.30 ± 1.28 log CFU/mg），4层与未包被相当（8.84 ± 0.93对8.72 ± 1.02 log CFU/mg），6层包被细菌则略低于未包被（8.26 ± 0.64 log CFU/mg），表明过厚的涂层可能限制细菌分裂。
**4.9 模拟胃肠道消化条件下的存活。** 在口腔阶段，所有包被细菌的活力与未包被无显著差异。胃相2小时结束时，2层包被细菌的活力显著高于未包被细菌（4.59 ± 0.28对3.51 ± 0.24 log CFU/mg）。肠相4小时后，2层包被细菌活力最高（4.19 ± 0.51 log CFU/mg），4层和6层包被细菌（3.52和3.48 log CFU/mg）也显著高于未包被细菌。延长至6小时后，包被细菌活力仍保持较高水平。结果表明LbL涂层增强了细菌在碱性pH、胰酶和胆汁盐环境下的耐受性，其中2层涂层保护效率最高。
**4.10 储存稳定性。** 在4°C储存60天期间，所有样品活力持续下降，但包被细菌的活力始终高于未包被细菌。未包被细菌从初始6.0 log CFU/mg降至4.9 log CFU/mg，而2、4和6层包被细菌分别降至5.7、5.4和5.4 log CFU/mg。在25°C环境条件下，包被细菌保持活力30天，未包被细菌仅20天，聚电解质包被在所有情况下均将存活时间延长了10天。
**五、讨论与结论**
关于多层组装的机理，研究者提出细菌糖萼这一由蛋白质和多糖组成的柔软多孔网络促进了聚电解质在初始组装阶段的扩散和积累，导致第一层PLL沉积量异常高；当糖萼饱和后，后续组装行为类似于刚性表面。这一发现与传统LbL体系中初始层不完整、第三层后沉积量增加的行为形成对比。
从规模化角度而言，与传统益生菌封装技术相比，LbL方法可在温和水相条件下进行，无需高温涂层步骤，但顺序聚合物沉积和清洗步骤增加了单元操作。该研究证明仅需两层聚电解质即可提供有效保护，减少了涂层和清洗循环次数，有利于简化未来的规模化生产。
研究结论指出，PLL和海藻酸盐在LAB C8细菌上的LbL组装形成均匀涂层，实现单细胞封装。流式细胞术显示第一层PLL沉积量大于后续各层，归因于细菌糖萼提供的软界面促进了过量聚合物的沉积。仅两层聚电解质即可形成有效的保护性聚合物屏障，增强细菌在冻干后和胃肠道模拟溶液中的存活率。2–4层为最优涂层厚度，在保护效果与细胞活力保持之间取得平衡；超过4层后，细菌生长和活力开始下降。由于糖萼的存在和第一层PLL层上较大的聚合物沉积量，最少仅需两层聚电解质即可建立有效的保护屏障，这一特性有利于规模化应用，减少了在细菌上生成保护性涂层所需的组装步骤。
