《Communications Chemistry》：Several multiple sequence alignment-perturbing methods enhance AlphaFold3 sampling of alternative protein states
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蛋白质功能通常涉及多种构象状态。已有研究表明，包括随机子采样（stochastic subsampling）、聚类（clustering）和列掩码（column masking）在内的多种多重序列比对（multiple sequence alignment，M
蛋白质功能通常涉及多种构象状态。已有研究表明，包括随机子采样（stochastic subsampling）、聚类（clustering）和列掩码（column masking）在内的多种多重序列比对（multiple sequence alignment，MSA）扰动策略能够增强AlphaFold2（AF2）对替代蛋白质状态的采样。在本研究中，研究人员在AlphaFold3（AF3）上评估了这些策略，并在107个具有多个实验解析构象状态的蛋白质上将其性能与BioEmu玻尔兹曼采样模型进行了比较。研究发现，未扰动的AF3以显著高于AF2的TM-score（模板建模分数，与BioEmu相当）对替代状态进行采样。特别地，所有MSA扰动方法均以统计学显著水平改善了AF3的采样，每种方法在大约20%的案例中将前1% TM-score提高了至少0.05，且极少使性能恶化。此外，研究人员发现，不同的氨基酸掩码选择可以改善特定目标的列掩码AF3采样。研究结果强调了MSA扰动在AF3中仍然具有重要意义，为理解动态生物过程提供了有用的工具。
**研究背景与问题**
蛋白质动力学对酶催化、受体信号传导和分子运输等多种生物功能至关重要。确定蛋白质在所有功能相关状态下的三维结构，能够为理解蛋白质功能提供深刻见解，并为合理药物设计奠定基础。尽管部分蛋白质已有不同构象的原子分辨率结构，但许多关键状态仍难以获得。对于这些情况，计算机模拟预测蛋白质构象状态具有重要价值，尤其是在缺乏高分辨率实验数据时，可为模型构建提供良好起始结构，并与功能学及低分辨率实验数据相结合。
人工智能方法如AlphaFold2（AF2）能以很高精度预测天然状态结构，但通常每个蛋白质仅预测单一构象状态。已有研究表明，通过对输入的多重序列比对（multiple sequence alignment，MSA）进行扰动，如随机子采样、序列聚类和列掩码，可使AF2为多个系统采样额外构象状态。更新的模型AlphaFold3（AF3）采用扩散模型，理论上具备原生采样不同状态概率分布的能力，但近期研究显示MSA列掩码仍可能改善其多构象采样。基于此，研究人员系统评估了多种MSA扰动技术对AF3采样的影响，并与专为原生采样玻尔兹曼构象分布的BioEmu模型进行了比较，以明确这些策略在AF3中的适用性和价值。
**研究内容与主要技术方法**
本研究在107个具有多个实验解析构象状态的蛋白质数据集上，对随机子采样、聚类和列掩码三种MSA扰动方法进行了系统基准测试，并与未扰动AF3、AF2及BioEmu进行比较，同时探索了氨基酸掩码选择对采样效果的影响。数据集来源于OC23、IOMemP和BioEmu多构象基准数据集v0.1，均为具有两个实验解析不同构象状态的蛋白质单体，结构从蛋白质数据银行（Protein Data Bank，PDB）下载，其中3个因预测失败被排除。结构预测使用UniProt规范序列，AF3默认数据管线生成MSA；AF3采用AlphaFold v3.0.0，每种方法生成1000个预测；AF2采用ColabFold v1.5.5，BioEmu采用bioemu-v1.1。评估指标为模板建模分数（template modeling score，TM-score），通过TM-align计算Cα原子获得，以每种方法对参考结构的前1% TM-score均值作为采样能力比较依据；使用Foldseek计算结构相似性并用Vendi score量化采样多样性。
**研究结果**
**MSA扰动增强AF3对替代蛋白质状态的采样。** 未扰动AF3对替代状态和优选状态的前1% TM-score均显著高于AF2。MSA列掩码、聚类和随机子采样均以统计学显著水平提高替代状态的采样得分，其中列掩码改善幅度最大，但模型整体置信度略有下降。所有扰动方法均显著提高了Vendi score，表明采样多样性增加。在107个蛋白质中，列掩码、聚类和随机子采样分别有24、18和16个案例将替代状态前1% TM-score提高至少0.05，而性能恶化案例仅分别为1、2和0。BioEmu虽然采样多样性显著高于AF3，但其替代状态前1% TM-score与未扰动AF3无显著差异，优选状态反而显著更低。在AF3训练截止日期后发布结构的9个蛋白质子集上，扰动方法的改善趋势依然保持。采样量分析表明，AF3的替代状态得分需数百个预测才趋于稳定，而BioEmu在1000个预测时仍在上升。在氨基酸掩码选择方面，使用苯丙氨酸（F）掩码在55个案例中有9个将TM-score提高至少0.05，优于其他氨基酸，但与标准的X掩码相比无统计学显著差异。
**AF3采样β-磷酸葡萄糖变位酶的开和闭构象，而AF2仅采样闭构象。** β-磷酸葡萄糖变位酶是底物结合后发生构象转变以催化磷酰基转移的酶。AF2采样的所有结构均紧密贴合闭状态（前1% TM-score均值〈TM1%〉=0.99），而无法采样开状态（〈TM1%〉=0.83）。相比之下，未扰动AF3同时采样了闭状态（〈TM1%〉=0.99）和开状态（〈TM1%〉=0.97）及中间构象，且MSA扰动方法未使得分降低超过ΔTM<0.02。
**列掩码使AF3能够采样钙转运ATP酶的额外状态。** 分泌途径Ca2?转运ATP酶1型的冷冻电镜结构均在AF3训练截止日期后解析，属于此前未见过的案例。未扰动AF3可采样金属游离磷酸化（E2P）状态和离子结合（CaE1）状态（〈TM1%〉均为0.95），但无法采样ATP和离子结合（E1-ATP）状态（〈TM1%〉=0.78）。引入列掩码后，AF3成功采样了E1-ATP状态（〈TM1%〉=0.91），优于聚类（0.87）及其他方法（<0.83）。
**用F代替X进行列掩码使AF3采样RNA解旋酶的apo状态。** 核仁RNA解旋酶2的apo和post-hydrolysis状态在X掩码时均无法被任何方法有效采样（〈TM1%〉<0.7），所有方法采样的构象均更接近post-unwound/pre-hydrolysis状态（〈TM1%〉≥0.97）。改用F掩码后，AF3采样了与apo状态高度相似的构象（〈TM1%〉=0.987），天冬氨酸（D）、精氨酸（R）和色氨酸（W）掩码也取得类似效果（〈TM1%〉分别为0.978、0.994和0.992）。通过重新采样20000个X掩码构象进行验证，仅1个构象TM-score达0.923，其余均低于0.7，排除了统计假象的可能。
**讨论与结论**
在讨论部分，研究人员指出，AF3相比AF2显著改善了替代状态的采样，MSA扰动尤其是列掩码可进一步提升采样效果，这一结论可推广到训练截止后解析的蛋白质结构，展示了方法的泛化能力。氨基酸掩码改变带来的改善不太可能完全归因于训练数据过拟合，因为即使在训练截止后发布的参考结构上也观察到了改善。使用特定氨基酸（如F）掩码的列可能模拟保守残基的环境，从而影响采样。实践上，列掩码AF3是预测多构象蛋白质的有利方法，当标准X掩码失效时可考虑更换氨基酸掩码。然而，对超过四分之一的测试蛋白质，所有方法均无法对至少一个实验参考结构采样到TM-score高于0.8的构象，表明当前方法在预测能力上仍有明显局限。区分生理相关构象与采样伪影是重要挑战，可通过结构聚类结合置信度评分，或将预测结构作为先验与功能学/低分辨率实验数据结合加以应对。研究人员最后指出，MSA扰动与AF3扩散模块修饰相结合是值得探索的未来方向。
**研究结论部分翻译：** 总而言之，研究人员证明了多种不同的MSA扰动可改善AF3中替代状态的采样。尽管这些方法本身无法捕捉完整的潜在玻尔兹曼分布，但它们提供了有价值的结构假设，并且未逊色于专门训练用于生成构象玻尔兹曼分布的BioEmu模型。通过与其他计算方法和实验数据互补，这些预测能够帮助人们更深入地理解底层生物过程，研究结论有望为专门设计用于采样完整构象景观的方法训练提供参考。
