阻断引物辅助粪便DNA宏条形码方法实现红腹滨鹬（*Calidris canutus*）食性的非侵入性解析

《Ecology and Evolution》：Developing a Fecal DNA Method With Blocking Primers to Determine Red Knots' (Calidris canutus) Diets Noninvasively

　　

理解红腹滨鹬（*Calidris canutus*）等迁徙鸻鹬类的食性对于评估栖息地质量、制定保护政策及监测生态系统健康至关重要。粪便DNA可作为传统方法的补充手段用于理解鸻鹬类食性，因其为食性分析提供了一种非侵入性、高效且高分辨率的替代方案。然而，粪便DNA面临的一个主要挑战是宿主DNA的存在，宿主DNA可在聚合酶链式反应（PCR）扩增中占据主导地位，从而阻碍摄入猎物DNA的检测。本研究中，研究人员设计了一种阻断引物（blocking primer），将红腹滨鹬（*Calidris canutus*）的DNA扩增比例从无阻断引物时的68.3%降低至使用该引物后的34.6%（配对*t* = 4.11，df = 10，*p* = 0.002；Wilcoxon符号秩检验*p* = 0.003）。该方法在马萨诸塞州科德角（Cape Cod, MA）的野外样本（*n* = 52）中得到验证，鉴定出多种猎物类群，其中包括该地区的一种主要猎物——鲎（*Limulus polyphemus*）卵。本研究的成功证实了阻断引物在以宿主为主导的环境DNA（eDNA）样本食性评估中的实用价值。

**论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

迁徙鸻鹬类在停歇地依赖高质量食物资源补充脂肪储备，以满足长距离迁徙的能量需求。食物组成直接影响其能量摄入、脂肪储存、迁徙成功率乃至总体存活率。红腹滨鹬（*Calidris canutus*）是中型鸻鹬类，其rufa亚种（*Calidris canutus rufa*，以下简称rufa红腹滨鹬）迁徙距离最长，往返于北极繁殖地与南美洲越冬地之间，总行程可达30,000公里，已被列入美国《濒危物种法》受威胁名录。在迁徙途中，鲎（*Limulus polyphemus*）卵是rufa红腹滨鹬在北美大西洋沿岸停歇地的关键食物资源。然而，许多停歇地正面临开发、海平面上升、水产养殖、渔业、娱乐干扰和气候变化等多重压力，可能导致鸻鹬类种群显著下降。马萨诸塞州科德角的Monomoy-Pleasant Bay系统是红腹滨鹬南迁（秋季）期间的重要停歇地，每年为约1500–2000只个体提供关键资源，但数量已从十年前的约5000只明显下降，其原因尚不清楚。尽管已有关于该地区红腹滨鹬觅食模式的观察性研究发表，但尚无与鸻鹬分布相关的定量猎物研究。

传统鸻鹬类食性鉴定方法各有局限：直接观察法仅能记录可见猎物，容易遗漏小型易吞咽的猎物；排泄物检查法对软体猎物代表性不足且需要较高的分类学分辨率；胃内容物取样等侵入性方法需要捕获鸟类进行胃灌洗，存在致伤或致死风险。粪便DNA宏条形码（fecal DNA metabarcoding）作为一种敏感、非侵入性的替代技术，可克服上述局限，但面临宿主DNA在PCR扩增中占主导地位从而掩盖猎物信号的重大挑战。阻断引物（blocking primer）可结合宿主DNA而不扩增之，从而抑制宿主DNA扩增、提高猎物DNA的检出率。此外，DNA提取方法的选择对扩增成功率、测序质量和分类学分辨率也有重要影响。因此，开展本研究旨在：（1）设计并开发阻断引物以减少红腹滨鹬DNA扩增并提高猎物DNA扩增；（2）测试适用于粪便和沉积物样本的DNA提取试剂盒；（3）在科德角Monomoy-Pleasant Bay系统的野外样本中验证阻断引物检测流程。

**二、主要技术方法概述**

研究人员比较了三种商业DNA提取试剂盒（Qiagen PowerSoil Pro Kit、Zymo Midi Kit、Zymo Mini Kit）对粪便和沉积物样本的提取效果，以DNA浓度和宏条形码群落组成作为评价指标。阻断引物设计基于Leray COI通用动物引物组（mlCOIintF/jgHCO2198），通过将引物序列与红腹滨鹬COI序列（GenBank登录号MK262432）进行比对，筛选出与正向引物重叠约10 bp并向红腹滨鹬COI序列内延伸10–15 bp的候选阻断引物，经凝胶电泳筛选后确定F2S（5′-CAGTATACCCCCCACTCGCTGG/3SpC3/-3′）为最优阻断引物。野外验证样本于2022年7月至11月每月采集一次，涵盖科德角六个地点（Nauset、North Beach、North Monomoy、Minimoy、Tern Island、Little Sipson），共采集32份粪便样本和76份沉积物样本（合并为20个复合样本）。宏条形码采用两步PCR法，测序平台为Illumina MiSeq 2×300 bp，生物信息学分析使用DADA2流程结合MIDORI2参考数据库和本地BLAST进行物种分类注释，并通过阴性对照的最大读取数进行污染扣除。

**三、主要研究结果**

**3.1 DNA提取试剂盒测试**

三种提取试剂盒对粪便和沉积物样本的DNA产量均有显著影响。对于粪便样本，Qiagen PowerSoil Pro Kit的DNA产量最高（浓度范围2–4 ng/μL，*p* = 2.04×10^?8）；对于沉积物样本，Zymo Midi Kit的DNA产量最高（浓度范围15–90 ng/μL，*p* = 0.00747）。Zymo Mini Kit在两类样本中的DNA产量均最低。然而，在Qiagen PowerSoil Pro与Zymo Midi试剂盒之间，扩增子序列变异体（ASV）丰富度（*p* = 0.336）、Shannon多样性（*p* = 0.644）、Chao1预测丰富度（*p* = 0.298）以及群落组成（PERMANOVA R² = 0.060，*p* = 0.063）均无显著差异，表明提取试剂盒选择对下游宏条形码群落分析结果影响不显著。

**3.2 阻断引物验证**

实验室测试中，候选阻断引物F2S能显著降低红腹滨鹬DNA扩增而不明显影响无脊椎动物DNA扩增。生物信息学比对显示，F2S与五种主要猎物（包括*Limulus polyphemus*）之间无8个及以上连续碱基的精确匹配（全长22 bp的最佳一致性为50%–54.5%），排除了阻断引物直接结合猎物DNA的可能性。在野外粪便配对样本中（*n* = 11对检出宿主DNA），宿主DNA平均比例从无阻断引物时的68.3%显著降至使用阻断引物后的34.6%（配对*t* = 4.11，df = 10，*p* = 0.002）。猎物物种丰富度在使用阻断引物后平均增加1.75种（配对*t*检验*p* = 0.033），但Shannon多样性和群落组成无显著变化。沉积物配对样本中（*n* = 7对），阻断引物对Shannon多样性（*p* = 0.615）和群落组成（PERMANOVA R² = 0.013，*p* = 0.234）均无显著影响，丰富度差异接近但未达显著水平（*p* = 0.053）。在五种最丰富猎物物种的逐种分析中，阻断效应呈现物种特异性：*Limulus polyphemus*的相对丰度增加1.83倍，*Littorina littorea*增加2.08倍，*Chiridotea coeca*增加1.41倍，而*Cassidinidea lunifrons*和*Alitta virens*分别下降至0.46倍和0.53倍，后两种各有1对样本出现完全抑制。

**3.3 红腹滨鹬食性野外调查**

52份测序样本（32份粪便和20份合并沉积物）共获得3,256,923条高质量序列，产生4717个独特ASV，其中约72%获得分类学鉴定，主要属于双壳纲（Bivalvia）、蛛形纲（Arachnida）、软甲纲（Malacostraca）、肢口纲（Merostomata）、环带纲（Clitellata）、腹足纲（Gastropoda）、多毛纲（Polychaeta）和昆虫纲（Insecta）。粪便样本中以肢口纲和软甲纲最为丰富，这与红腹滨鹬的已知食性一致。粪便样本群落组成在不同采样地点间差异显著（PERMANOVA R² = 0.134，*p* = 0.009），粪便与沉积物样本间的群落组成也存在显著差异（PERMANOVA R² = 0.038，*p* = 0.001），但效应较小且可归因于组间变异度差异（*p* = 0.029）。沉积物样本不同地点间群落组成差异显著（R² = 0.351，*p* = 0.001）。值得注意的是，在采样期间（7月至11月），鲎卵在粪便和沉积物样本中均被检出，表明尽管鲎产卵活动在7月以后大幅减少，鲎卵在南迁季节仍然存在于环境中并被红腹滨鹬取食。

**四、讨论总结与研究结论**

本研究成功验证了一种红腹滨鹬宿主特异性阻断引物，该引物针对Leray COI引物组设计，能显著降低宿主DNA扩增比例（从68.3%降至34.6%），同时增加猎物物种检出数，而不改变猎物群落整体组成。阻断引物对沉积物中非靶标生物群落无显著影响，进一步支持了其特异性。在无阻断引物的情况下，部分样本中宿主DNA占测序总读数的比例高达99.3%，几乎完全掩盖了食物信号，而阻断引物的应用有效缓解了这一问题。

本研究存在若干局限：采样仅覆盖南迁季节；宏条形码反映的是猎物类群的相对序列丰度而非生物量，且无法区分猎物生活史阶段（如鲎卵与幼虫）；沉积物中检出的猎物类群描述的是环境背景而非直接取食证据；阻断引物抑制效果在个别样本中不明显。尽管如此，整体结果的一致性表明该阻断引物检测流程有效且可扩展。

在生态学意义上，检出类群以桡足类、甲壳动物、软体动物及其他底栖无脊椎动物为主，证实红腹滨鹬在迁徙停歇期间具有机会主义觅食策略。尤为重要的是，鲎卵在南迁季节的检出表明这一关键猎物资源在春秋两季迁徙中均具有重要意义，考虑到rufa红腹滨鹬的受威胁状态及马萨诸塞州鲎种群面临的持续捕捞压力，该发现对保护管理和鲎资源保护策略具有重要参考价值。

综上，本研究证实将红腹滨鹬阻断引物与Leray COI引物组联用是鉴定粪便和沉积物中猎物类群的有力工具，为迁徙鸻鹬类的食性评估提供了一种可推广的非侵入性方法。未来研究可纳入跨季节采样以追踪食性时间变化，进一步完善对迁徙鸻鹬类觅食生态学的理解并服务于保护管理策略的制定。