# 孟加拉国土壤来源的芽孢杆菌噬菌体APU1：基因组学特征与比较基因组学分析

《Environmental Microbiology Reports》：A Bacillus Phage From Bangladeshi Soil, Phage APU1: Genomic Characterisation and Comparative Genomic Analysis

　　

# 摘要

芽孢杆菌属（*Bacillus*）物种是一类与环境耐受性相关的细菌，广泛存在于土壤、食品、工业环境及机会性感染中，然而其噬菌体仍未得到充分表征，尤其是来自未充分探索的环境来源的噬菌体。研究人员从孟加拉国农业土壤中分离并表征了一株双链DNA（dsDNA）噬菌体APU1。通过部分16S rRNA基因测序，保守地将富集宿主鉴定为芽孢杆菌属（*Bacillus* sp.）。APU1基因组大小为153,847 bp，编码236个预测蛋白质，其中84个长度短于100个氨基酸。CheckV将该基因组分类为高质量基因组，估计完整度为99.91%，且未检测到宿主基因污染。功能注释鉴定出与DNA复制、结构组装、包装及宿主裂解相关的基因。PhaBOX将APU1分类为溶原性（毒力性）噬菌体，其中PhaTYP和CHERRY预测评分均为1.0。通过CARD/VFDB筛选，未检测到CARD列出的抗菌素耐药基因或VFDB列出的毒力因子基因。使用VICTOR、VIRIDIC和VIPTree进行的比较基因组学分析将APU1置于一组相关芽孢杆菌噬菌体之中。APU1与其最近缘物种的基因组间相似性为89.7%–89.8%，支持其在该组内被分类为一个基因组上具有显著差异的噬菌体。本研究扩展了孟加拉国土壤来源的芽孢杆菌相关噬菌体的基因组目录，并为未来关于噬菌体多样性、宿主范围、形态学及生物学特性的研究奠定了基础。

# 孟加拉国土壤芽孢杆菌噬菌体APU1的基因组学特征与比较基因组学分析：论文解读

## 1 研究背景与问题的提出

噬菌体（bacteriophage）是感染细菌并在其中复制的病毒，可通过裂解性（lytic）或溶原性（lysogenic）两种循环方式存在。它们在几乎所有环境中都极为丰富，在调控细菌种群数量、塑造微生物群落动态以及驱动水平基因转移方面发挥着重要作用。与化学抗菌药物不同，噬菌体具有高度特异性，不会对植物、动物、人类或非靶标微生物造成伤害，因此被视为治疗性和生物技术应用的重要候选工具，包括抗菌疗法、疫苗递送、噬菌体展示系统、食品安全生物防控和细菌分型等。

然而，土壤病毒组（soil virome）的研究仍然十分不足。据估计，多达97%的病毒存在于土壤和沉积物等固体基质中，但公共可用的病毒宏基因组数据中仅有1.8%来源于土壤。这一巨大的数据缺口限制了对噬菌体多样性及其在生态过程中作用的认识。

芽孢杆菌属包含多种物种，如地衣芽孢杆菌（*Bacillus licheniformis*）、枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）和短小芽孢杆菌（*Bacillus pumilus*），其中部分与食源性疾病相关。短小芽孢杆菌尤其值得关注，它可感染植物、动物和人类，并对紫外线辐射、电离辐射、高盐浓度等极端胁迫表现出高度抗性，且易于形成生物膜，这使得常规方法难以控制。已有研究表明，短小芽孢杆菌对过氧化氢的耐受浓度可达其他芽孢杆菌物种的三倍。噬菌体及其裂解酶被认为是靶向芽孢杆菌属的有前景的替代方案，特别是在清除芽孢和生物膜方面。

尽管芽孢杆菌噬菌体具有重要意义，但其表征仍然不足。GenBank中仅存放了约一百多个完整的芽孢杆菌噬菌体基因组。芽孢杆菌噬菌体的多样性和宿主范围在很大程度上仍然未知，该类群在培养组学和宏基因组学研究中均代表性不足。虽然已有若干感染芽孢杆菌的噬菌体完成了测序，但许多尚未使用现代基因组学和系统发育基因组学工具在物种水平上进行评估。因此，从未被充分探索的环境来源分离和表征新的芽孢杆菌噬菌体，对于填补这一知识空白至关重要。

## 2 研究目标

为解决上述问题，本研究从孟加拉国达卡某奶牛场的农业土壤样品中分离了一株靶向芽孢杆菌属的噬菌体APU1。研究采用全基因组测序确定其基因组结构，通过功能注释鉴定推定基因和代谢途径，并利用比较基因组学分析评估其与其他芽孢杆菌感染噬菌体的分类学关系。该研究旨在扩展芽孢杆菌相关噬菌体的基因组目录，为未来噬菌体多样性、宿主范围、形态学和生物学特性的研究奠定基础。

## 3 主要关键技术与方法

研究人员从孟加拉国达卡某奶牛场采集土壤样本（2024年收集），使用芽孢杆菌属菌株（来源：国际腹泻病研究中心孟加拉国（icddr,b）基因组中心生物库）作为富集宿主进行噬菌体分离。通过双層琼脂法确认噬菌体存在并观察噬菌斑形态。对富集宿主菌株进行部分16S rRNA基因测序（引物27F/1492R），经BLASTn比对保守地鉴定为芽孢杆菌属。噬菌体DNA提取后，使用Illumina DNA Prep Kit建库，在Illumina MiSeq平台进行双端测序（2×250 bp）。原始读段经FastQC和Trimmomatic质控修剪后，使用SPAdes v3.15.5进行*de novo*组装，QUAST评估组装质量。基因组注释采用Pharokka v1.7.3和PhageScope并行完成；完整性通过CheckV v1.0.1评估；tRNA由ARAGORN v1.2.38鉴定；跨膜螺旋经TMHMM v2.0检测；保守结构域分析使用InterProScan 5。生活方式预测采用PhaBOX套件（PhaTYP、CHERRY、PhaVIP、PhaMer）；抗菌素耐药基因和毒力因子基因分别通过CARD和VFDB数据库经MMseqs同源搜索筛查。比较基因组学分析使用VICTOR（GBDP D6公式）、VIRIDIC（基因组间平均核苷酸一致性）和VIPTree（tBLASTx蛋白组聚类），与INPHARED数据库检索获得的19株已知芽孢杆菌噬菌体进行比较。

## 4 主要研究结果

### 4.1 噬菌体APU1的分离与噬菌斑形态

噬菌体APU1采用芽孢杆菌属作为富集宿主，从孟加拉国达卡某奶牛场采集的土壤中分离获得。双層琼脂平板上形成清晰、圆形、边界分明、直径约0.5–1.5 mm的噬菌斑，在37°C培养16–18小时后观察。斑点试验（spot test）使用高滴度裂解液（约10? PFU/mL）在新鲜芽孢杆菌菌苔上产生完全裂解区，提示APU1在测定条件下对测试的富集宿主具有裂解活性。经连续多轮纯化后噬菌斑形态保持一致，表明克隆稳定性良好。对富集宿主的部分16S rRNA基因测序获得了788 bp的共有序列。BLASTn分析将该菌株置于芽孢杆菌属内，最近匹配包括厦门芽孢杆菌（*Bacillus xiamenensis*）、高地芽孢杆菌（*Bacillus altitudinis*）和嗜气芽孢杆菌（*Bacillus aerophilus*），各匹配均显示100%查询覆盖率、E值为0和99.62%序列一致性。由于多个芽孢杆菌物种产生等效的BLASTn最佳匹配，该富集宿主被保守地鉴定为芽孢杆菌属物种。

### 4.2 基因组测序、组装与一般特征

APU1具有153,847 bp的线性dsDNA基因组，编码236个预测CDS，GC含量为41.16%。基因组呈模块化结构，包含复制、结构组分和裂解功能的预测功能簇。CheckV根据MIUViG标准将APU1基因组分类为高质量基因组，基于AAI高置信度方法估计完整度为99.91%，估计污染率为0.0%，未检测到宿主基因。ARAGORN注释鉴定出5个tRNA基因（2个tRNA-Met(cat)、1个tRNA-Tyr(gta)、1个tRNA-Phe(gaa)、1个tRNA-Asn(gtt)），未发现tmRNA。TransTermHP预测出36个Rho非依赖性转录终止子，表明跨基因组存在紧密调控的转录单元。基因组编码关键功能蛋白，包括尾部相关裂解酶、肽聚糖水解酶和类终止酶包装蛋白。TMHMM分析未在任何预测蛋白中检测到跨膜螺旋。

### 4.3 基因组注释、功能预测与生活方式分析

基因组注释揭示了236个预测CDS，其中84个预测蛋白质短于100个氨基酸并在最终注释中全部保留。InterProScan在70个预测蛋白中鉴定出与关键噬菌体功能相关的保守结构域/蛋白匹配，包括头部门户蛋白（IPR006944）、前头丝氨酸蛋白酶（IPR054613）、尾部刺突水解酶、肽聚糖酰胺酶（IPR002502）以及具有ATPase和螺旋-转角-螺旋基序的调节蛋白。基因本体论（Gene Ontology）注释主要与病毒粒子结构和感染相关过程相关。未注释到可识别的辅助代谢基因。CARD/VFDB筛选在所用阈值下未检测到CARD列出的抗菌素耐药基因或VFDB列出的毒力因子基因。

PhaBOX将APU1分类为毒力（裂解性）噬菌体，PhaTYP和CHERRY预测评分均为1.0。最终基因组注释的人工检查未鉴定出典型的整合酶、切除酶、CI阻遏物或Cro阻遏物基因。PhaVIP模块对236个预测CDS中的224个进行了注释，注释率为95%。计算宿主预测（基于CRISPR的数据库方法）将APU1的预测宿主定为Bacillus sp. TH007，预测属为Agatevirus，预测谱系为Duplodnaviria > Caudoviricetes > Agatevirus。

### 4.4 比较基因组学与系统发育分析

VICTOR全蛋白质组距离分析将APU1定位在属水平的Cluster 5内，与芽孢杆菌噬菌体phiAGATE、Bobb、Bp8p-C和Bp8p-T并列。该分支表现出一致的芽孢杆菌物种宿主特异性、可比的基因组大小（150–160 kbp范围），以及高蛋白质组相似性（D6 < 0.3），支持它们归属于同一属。在此组内，APU1形成独立分支，表明该噬菌体在保持与整体簇相关性的同时存在基因组分化。

VIRIDIC评估的基因组间相似性显示，APU1与芽孢杆菌噬菌体Bp8p-T和Bp8p-C的平均核苷酸一致性（ANI）分别为89.75%和89.74%，低于ICTV物种划分阈值的95%，确认APU1代表同一属内的一个基因组上具有显著差异的变体。

VIPTree推断的基于蛋白质组的系统发育揭示了APU1与其最近亲缘物种（Bp8p-C、Bp8p-T和Bobb）之间的强烈蛋白质组相似性，成对蛋白质组相似性得分（Sh > 0.15）超过ICTV指南建立的属级阈值。全基因组比对进一步验证了这些关系，表明四种噬菌体间存在保守的共线性（synteny），APU1中具有微小基因组重排以及散布的高核苷酸一致性区域（>85%）。

## 5 讨论与结论

本研究呈现了从孟加拉国土壤中分离的感染芽孢杆菌属的噬菌体APU1的高质量组装基因组及其比较分析。APU1的基因组特征与预测的裂解性生活方式一致：PhaBOX分类为毒力噬菌体（PhaTYP和CHERRY评分均为1.0），且人工检查未发现典型溶原性相关基因。CARD/VFDB筛选未检测到抗菌素耐药基因或毒力因子基因，这在考虑未来潜在应用时是一个有意义的特征。

基因组的模块化组织（复制、结构组装和宿主裂解的功能簇）反映了其他毒力芽孢杆菌噬菌体中所见的有效特化设计。比较基因组分析将APU1置于一个公认的感染芽孢杆菌属的噬菌体属中。尽管VICTOR和VIPTree分析显示与Bp8p-C、Bp8p-T和Bobb存在明确的蛋白质组聚类，但VIRIDIC计算的基因组间相似性是决定性的。与最近亲缘物种的ANI值为89.7%–89.8%，低于用于物种划分的95%阈值，确认APU1是该属内的一个不同物种。

本研究的主要意义在于对稀疏基因组景观的贡献。从不同地理和生态位（如本研究采样的农业土壤）中分离和表征噬菌体，对于绘制病毒世界的真实多样性和理解噬菌体-宿主共进化至关重要。来自局部环境的噬菌体可能具有与环境相似的细菌种群管理相关的适应性。尽管APU1并非临床分离株，但芽孢杆菌属在工业和环境背景下的耐受性使此类噬菌体与探索未来非抗生素控制策略具有相关性。

**研究结论：** APU1是一株从孟加拉国土壤中分离的芽孢杆菌噬菌体，具有高质量组装的基因组和计算预测的裂解性生活方式。其价值在于详细的基因组特征化，明确了其分类位置并为未来研究奠定了基础。后续工作应侧重于其宿主范围的实验验证、基因产物的结构分析以及功能研究，以解析其独特遗传特征的作用。