《Zoologica Scripta》：Differentiation and Population Structure of Idyla bicristata (Gastropoda: Clausiliidae) on Euboea, Greece
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Idyla bicristata是一种高度变异的岩栖门螺（door snail）物种，栖息于爱琴海周边的石灰岩岩壁上。Euboea岛及邻近的希腊大陆是I. bicristata形态变异的热点区域，因此多种形态被命名。研究人员基于超过10,000个限制性位点关联
Idyla bicristata是一种高度变异的岩栖门螺（door snail）物种，栖息于爱琴海周边的石灰岩岩壁上。Euboea岛及邻近的希腊大陆是I. bicristata形态变异的热点区域，因此多种形态被命名。研究人员基于超过10,000个限制性位点关联DNA标记（restriction-site associated DNA markers）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs），对23个I. bicristata种群进行了种群遗传分析，揭示出两个种群组，这两个种群组同时存在于Euboea岛及邻近的希腊大陆。它们的分布对应于两个具有不同地质特征的构造带（tectonic zones）。南部组的种群分化更强，并且相对于北部种群组呈并系性（paraphyly），后者通过星状辐射（star-like radiation）发生分化。这些组间关系提示Euboea是由南部拓殖的。贝壳大小、雕刻纹饰及白色表面层的发育程度依赖于降水等环境参数。此前命名的大多数形态型并不代表独立的种群组，而是对当地环境条件的适应，甚至是非遗传性修饰。
**一、研究背景与科学问题**
Idyla bicristata（Rossm?ssler, 1839）是一种分布于希腊和土耳其爱琴海周边石灰岩岩壁上的门螺（door snail）物种，隶属于腹足纲（Gastropoda）烟管螺科（Clausiliidae）。该物种表现出广泛的地理变异，19世纪以来研究者已基于单个或少数种群命名了30多个形态变种，Nordsieck（2007）将其中的13个认定为亚种。然而，这一分类并非基于系统修订，各分类单元之间的差异、变异范围及分布格局仍 largely unknown（未知）。Euboea岛（即Evvoia）是该物种形态变异的中心，有9个命名分类群的模式产地在此。Boettger（1883, 1889）曾将Euboea的Idyla种群划分为三个物种——Clausilia bicristata、C. kephissiae和C. eustropha，依据是贝壳大小、雕刻、颜色、壳口形态及两条龙骨（keels）的发育程度。Zilch（1976）和Nordsieck（2007）将其视为I. bicristata的亚种，但缺乏系统发育和种群遗传学分析支持。现有研究仅对胎生（viviparous）繁殖方式有较详细记录（Sulikowska-Drozd et al. 2019）。因此，需要利用现代种群基因组学方法，评估I. bicristata在Euboea及邻近大陆的种群遗传结构，检验形态变异是否反映种群间深层分化，并探讨环境因素对形态多样性的影响。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员对来自Euboea岛、邻近希腊大陆及伯罗奔尼撒半岛的23个I. bicristata种群共115个个体，采用双酶切限制性位点关联DNA测序（double digest restriction-site associated DNA sequencing, ddRADseq）技术，获得了10,471个位点（loci）和10,033个SNP标记。基于Structure聚类、隔离距离（isolation by distance, IBD）检验、最大似然（maximum likelihood, ML）系统发育树和邻居网络（neighbour-net）分析，揭示了两个遗传分化显著的种群组：北部组（种群1-19）和南部组（种群20-23），两者的地理分布与希腊的两个大地构造单元——Pelagonian Zone和Attico-Cycladic Zone——的分界（Pelagonian断层）基本吻合。南部组内部遗传分化更强，且相对于北部组呈并系性（paraphyly）；北部组以星状辐射（star-like radiation）模式分化，提示其可能是由南部拓殖并迅速扩张至Euboea北部和中部。形态与环境关联分析显示，贝壳大小、肋纹密度和白色表面层发育与年降水量等环境变量显著相关，大多数先前命名的形态型更可能是局部环境适应或非遗传修饰，而非独立进化的种群组。
**三、关键技术方法**
1. **ddRADseq文库构建与测序**：采用quaddRAD协议（Franchini et al. 2017）构建双酶切限制性位点关联DNA文库，在Illumina HiSeq X平台进行双端150 bp（2 × 150 bp）测序；原始数据经stacks v2.62流程进行质量过滤、去重复、位点组装和SNP genotyping。
2. **种群遗传结构分析**：使用Structure 2.3.4进行基于个体的贝叶斯聚类和admixture分析，通过ΔK和L(K)估计最优K值；使用stacks计算各群体私有SNP（private SNPs）数量和核苷酸多样性π（nucleotide diversity π）。
3. **隔离距离检验与系统发育网络**：采用Hausdorf和Hennig（2020）的IBD检验框架，基于共享等位基因距离（shared allele distances）评估种群间分化是否仅由地理距离解释；利用RAxML-NG基于concatenated ddRAD loci构建最大似然树，并使用Splitstree4构建neighbour-net网络。
4. **形态与环境关联分析**：测量贝壳高度、直径、体积、肋密度和白色表面层存在性，从WorldClim 2.0和SoilGrids250m获取年降水量、年均温和土壤pH数据，通过广义线性模型（generalised linear model, GLM）和Mann–Whitney U检验分析其相关性。
样本采集范围包括Euboea岛（种群1-16、18、21、22）、希腊大陆（种群17、19、20）和伯罗奔尼撒半岛（种群23），共115个标本用于遗传学分析，另有Strigileuxina reuleauxi和Sumelia rolli各一标本作为外群。
**四、研究结果**
**4.1 测序与SNP检出（Sequencing and SNP Calling）**
16个pool（每池12个体）的双端测序共产生9.019亿条151 bp读数，经去除PCR重复（4.23%-44.39%）和质量过滤后保留5.871亿条。两个样本因读数过低被剔除。stacks参数优化（m=3, M=4, n=5）后，去除在少于50%比对中出现的10个个体，最终105个个体（含外群）在≥80%个体中呈现10,471个位点（总长2,136,679 bp，平均194.1 bp）。Structure分析等采用从10,953个位点中每基因座随机选取一个SNP的数据集（共10,033个SNP）。
**4.2 种群遗传结构（Population Genetic Structure）**
Structure分析中，K=2时ΔK最高，且长运行结果与短运行一致。K=2划分为北部种群组（种群1-19，涵盖Euboea北部和中部及邻近大陆）和南部种群组（种群20-23，涵盖Euboea南部、Attica东部和伯罗奔尼撒半岛）。大部分种群admixture比例极低（≤6.7%），即使相距仅约10 km的种群19和20之间也未显示明显基因流。唯一的例外是位于Euripus海峡附近的种群17，该种群以北部组祖先成分为主，但含有高达46.8%的南部组混合。
**4.3 隔离距离检验（Isolation by Distance Tests）**
IBD检验表明，基于北部种群组内部遗传-地理距离关系，南北两组间的遗传分化不能被纯地理距离（IBD）所解释；但基于南部种群组内部更强烈的遗传-地理距离关系，南北分化则可以由IBD解释（表2）。这一结果支持两个种群组之间存在非连续性的遗传隔离。
**4.4 系统发育与网络分析（Phylogenetic and Network Analyses）**
基于10,471个位点concatenated序列构建的最大似然树显示，南部种群组（20-23）构成并系群，北部种群组（1-19）作为单系群嵌套于其中；北部组内部，最北端种群嵌套在中Euboea和邻近Attica种群之内，种群17为所有其他北部种群的姐妹群，伯罗奔尼撒种群23是北部组的姐妹群，Euboea最南端种群22位于所有其他I. bicristata种群之外。邻居网络显示北部组呈星状辐射拓扑，南部组内部则具有更长的分支和更强的分化，种群17位于两组之间。
**4.5 环境参数对形态的影响（Effects of Environmental Parameters on Morphology）**
年降水量与年均温高度负相关（r=?0.90），分析中聚焦于降水量。广义线性模型显示，贝壳体积随年降水量显著增加（F=162.85, p<2.2×10
?16），pH对贝壳体积无显著影响。Mann–Whitney U检验表明，光滑壳个体显著更常见于高降水量、低pH位点；具有浅色表面层的个体显著更常见于高降水量位点，但与pH无显著关系。
**五、讨论总结与结论**
研究人员提出，南北种群组的边界对应Pelagonian断层及两个不同地质构造带，不同基岩（非变质石灰岩与变质石灰岩-页岩）可能营造了不同的微生境和生态条件，这种分化可能代表早期阶段的生态物种形成（ecological speciation），但需进一步检验两组是否对岩石化学和物理性质存在差异适应。北部组的星状辐射提示其近期快速扩张，结合南部组的并系性及北部组较低的私有SNP数量，支持Euboea由南部殖民的假说。形态变异方面，沉积环境（降水）对壳形、肋饰和表面层有显著影响，故多数19世纪命名的形态型应视为环境适应或表型可塑性，而非独立遗传谱系。基于遗传分化及有限的基因流，研究人员认为南北两组已达亚种水平的区分度；但南部组采样不足，单倍型网络和ML树均显示其内部有进一步细分可能（如伯罗奔尼撒种群23可能代表独立亚种I. bicristata acuticosta）。要全面修订I. bicristata的亚种分类，仍需覆盖其整个分布区（环绕北爱琴海）的种群样本，并结合贝壳形态、生殖器解剖和遗传数据综合分析。
