多层次审计方法揭示细菌功能筛选中重叠假开放阅读框导致的假阳性问题

《Journal of Microbiological Methods》：Auditing bacterial dark-gene screens for superimposed open reading frame artefacts: A multi-layer analysis of Rv2438A in Mycobacterium tuberculosis

　　**摘要**功能必需性筛选和功能干扰敏感性筛选可能会提升虚假的细菌开放阅读框，当这些阅读框与必需基因发生重叠时，因为这样的阅读框会完整继承邻近基因的信号且未经稀释，从而比真正的微小基因更能满足筛选标准。我们提出了一种多层次审计方法，从基因组注释、转座子诱变、CRISPR干扰、同源性、转录本比对、蛋白质组学和群体变异等多个维度检测这种失效模式。我们将该方法应用于Rv2438A——结核分枝杆菌中一个92个密码子的保守假设开放阅读框，在我们自身的暗基因靶点筛选中排名第一。Rv2438A叠加于必需的NAD合成酶基因座nadE之上：其中44%位于该基因的编码序列上（处于互补链），其余部分覆盖其启动子和转录起始位点。因此，五个Himar1转座子位点中有三个落在nadE内；没有任何CRISPRi向导序列能在不结合nadE的情况下靶向Rv2438A；跨物种命中点也映射到同一nadE起始连接点。Rv2438A缺乏自身的转录起始位点，并且在所有检测到nadE的蛋白质组学数据集中均缺失。全基因组扫描在3907个注释基因中识别出六个短小、重叠且未表征的基因座，但只有Rv2438A同时具备重叠性与必需性，且在所有蛋白质组学数据集中均未检测到——这一特征在全基因组范围内极为罕见，而在筛选命中结果中排名第一。我们提供了一种可实施的审计工作流程和一种密码子位置对照，但经测量，该对照的灵敏度仅为五个已有蛋白质证据的基因中的两个，因此其应用仅限于确认性用途。因此，在优先选择细菌暗基因之前，应报告重叠坐标和邻近基因特异性的实验解析数据。Christophe GuyeuxMarie et Louis Pasteur大学，法国国家科学研究中心，FEMTO-ST研究所，90000 贝尔福特，法国