聚苯乙烯纳米/微塑料对高原干旱区叶尔羌高原鳅（Triplophysa yarkandensis）的粒径-浓度依赖性毒性效应：组织病理损伤、氧化应激与肠道微生物组响应

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Effects of N/MPs on aquatic organisms at high altitude in arid areas: Responses of physiological tissues and intestinal microbiome of Triplophysa yarkandensis

　　

纳米塑料与微塑料（N/MPs）已成为全球亟待解决的新型环境污染物，对脆弱生态系统的威胁尤为突出。调查显示，在青藏高原典型干旱内陆河流——塔里木河中广泛存在N/MPs污染纤维，其中颗粒物占主导地位且以小粒径颗粒为主，对其脆弱的水生生态系统构成严重威胁。本研究以干旱区高原特有濒危鱼类叶尔羌高原鳅（Triplophysa yarkandensis）为研究对象，通过生态毒理学暴露实验，将不同粒径（80 nm聚苯乙烯纳米塑料[NPs]、1 μm聚苯乙烯微塑料[MPs]）和不同浓度（100 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L、5000 μg/L）的N/MPs暴露21天，研究其对N/MPs富集、组织病理学特征、氧化应激水平及肠道微生物群落的影响。结果揭示N/MPs呈时间依赖性生物富集，前14天内富集速率较高。21天后，鳃组织N/MPs积累量（NPs: 23.10 μg/g; MPs: 12.10 μg/g）高于肠道（NPs: 17.90 μg/g; MPs: 9.20 μg/g）。高浓度NPs引发严重皮肤病变；高浓度MPs诱导肠道主导性损伤；所有暴露组均表现出普遍的肝脏空泡变性和鳃丝肿胀/空泡化（P<0.05）。第14天，所有暴露组活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及肠道乙酰胆碱酯酶（AChE）均显著升高，而丙二醛（MDA）含量较对照组显著下降（P<0.05）；肝脏SOD呈现明显的浓度依赖性敏感性。高浓度MP组（MH）显著提高肠道α多样性；门水平上变形菌门（Proteobacteria）占主导地位，而NH/MH组降低了变形菌门丰度并富集了厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes）；属水平群落结构呈现粒径特异性分化。本研究阐明了N/MPs对干旱区高原特有鱼类的粒径-浓度依赖性毒性机制，证实了N/MPs可通过诱导氧化应激、破坏组织完整性和扰乱肠道微生物群落稳态产生毒性效应。该研究为高原干旱区淡水生态系统中N/MPs的生态风险评估提供了科学依据，也为聚苯乙烯塑料对高原土著鱼类污染毒性的研究补充了新的实验证据。

**引言**

塑料因其耐腐蚀、耐久、绝缘及低成本等特性在现代社会中被广泛应用，但全球约63亿吨塑料废弃物中79%最终通过不当处置进入自然生态系统。环境中的大块塑料经机械磨损、生物降解和光氧化作用逐步碎裂为微塑料（MPs，<5 mm）和纳米塑料（NPs，<1 μm），这些塑料颗粒已广泛渗透至陆地和水生环境。聚苯乙烯（PS）是水环境中检出率最高的塑料类型，已有研究表明PS可诱导多种鱼类产生氧化应激、组织损伤和代谢紊乱。然而，现有研究多集中于低海拔平原鱼类，对于长期栖息于缺氧、强紫外线和高盐碱等特殊环境的高原鱼类，其生理代谢与应激响应机制与平原鱼类存在显著差异，N/MPs对其特异性毒性效应亟待研究。研究人员提出两项假设：（i）PS N/MPs对高原鱼类的毒性具有粒径和浓度依赖性，80 nm NPs发挥更强的渗透性纳米毒性，而1 μm MPs发挥机械磨损毒性；（ii）N/MP暴露可诱导高原鳅多器官组织病理损伤、氧化应激与神经毒性应激以及肠道微生物群失调。

**材料与方法**

*N/MPs与化学品*：采用非功能化、荧光标记的聚苯乙烯微球，粒径分别为80 nm（NPs）和1 μm（MPs），荧光染料封装于聚苯乙烯基质内部而非颗粒表面。预实验验证了标记与未标记颗粒在粒径分布、聚集行为及毒性效应上无显著差异。

*实验用鱼*：叶尔羌高原鳅（Triplophysa yarkandensis）为中国特有濒危水生野生动物，属高原鳅属（Triplophysa）赫定鳅亚属（Hedinichthys），是塔里木河水系的旗舰物种。实验鱼平均体重9.23±1.39 g，平均体长88.54±3.73 mm。实验经塔里木大学伦理委员会批准（2023027）。

*实验设计*：将叶尔羌高原鳅分为9组，包括空白对照组（CK）及NPs（80 nm）和MPs（1 μm）各四个浓度组（100 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L、5000 μg/L），分别记为NL、NML、NMH、NH和ML、MML、MMH、MH。暴露周期21天，每48小时全量更换暴露水体以维持N/MP浓度稳定。实验结束后用MS-222麻醉取样，每组取9尾鱼。

*N/MPs摄入与积累*：组织样品经氯化锌溶液密度分离、H₂O₂消解有机物后，采用0.45 μm银膜真空过滤，浓缩至200 μL进行热裂解-气相色谱/质谱联用（Py-GCMS）分析。裂解温度550°C，升温速率10,000°C/s，质谱采用电子电离模式（70 eV），质荷比范围0–850 m/z，降解产物经NIST谱库匹配鉴定。

*组织病理学分析*：取皮肤、中肠、肝脏和鳃组织，经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片（5–6 μm），苏木精-伊红（HE）染色，显微镜拍照。建立统一的病理损伤半定量评分标准（0–4级制），由两名病理学家独立盲法评分。

*氧化损伤检测*：按照制造商说明制备样品并测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性及丙二醛（MDA）含量。

*16S rRNA肠道微生物分析*：使用OMEGA Soil DNA Kit提取肠道总DNA，经0.8%琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop定量后，采用引物338F/806R扩增细菌16S rRNA基因V3-V4高变区，利用Illumina平台进行双端测序，在QIIME2（版本2022.11）中进行生物信息学分析。

*统计分析*：采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，显著性水平设为P<0.05。16S rRNA差异丰度分析采用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正。

**结果**

*N/MPs摄入与积累*：MH组和NH组鳃组织和肠道组织中N/MPs富集量呈时间依赖性增加，前14天富集速率显著快于后期。21天后鳃组织NPs和MPs积累量分别为23.10 μg/g和12.10 μg/g，肠道组织分别为17.90 μg/g和9.20 μg/g，鳃积累量均高于肠道。

*组织病理学分析*：N/MPs暴露后，皮肤组织形态改变、完整性破坏，NH组皮肤病变最为严重。肠道细胞出现空泡化、坏死脱落及组织结构溶解，MH组肠道病理损伤更为严重。所有8个暴露组肝脏均出现严重脂肪变性，主要表现为空泡变性和肝细胞坏死，伴纤维化改变。鳃组织出现结构紊乱、肿胀、脱落、增厚和融合，NMH和NH组鳃丝脱落和肿胀更为严重。组织损伤程度与N/MPs浓度呈正比，与粒径呈反比。

*酶活性分析*：与CK组相比，所有N/MPs暴露组鳃、肝脏和肠道中SOD活性均显著升高（P<0.05），肝脏对N/MPs浓度的响应更为敏感。所有N/MPs组MDA含量均显著低于CK组（P<0.05），肠道MDA水平最高。GSH-Px活性在各组和各时间点间均无显著差异（P>0.05）。所有N/MPs组AChE活性均显著高于CK组（P<0.05），但第7天NH和MH组肝脏AChE活性显著低于其他组（P<0.05）。N/MPs组鳃和肠道CAT活性显著高于CK组（P<0.05），肝脏CAT无显著差异（P>0.05）。

*对肠道微生物群落与功能的影响*：α多样性分析显示，不同处理对微生物群落α多样性具有显著影响（各指数组间P<0.05）。MMH组显著提高了物种丰富度（Chao1、Observed_species）和系统发育多样性（Faith_pd），且未降低物种均匀度（Pielou_e），整体多样性（Simpson、Shannon）显著优于CK对照组；NH和MH组则显著抑制了群落丰富度、均匀度和系统发育多样性。β多样性分析（PCA和UMAP降维）显示，NL、NML、NMH与CK组群落结构高度相似，NH和MH组形成独立群体，ML组为单独群体，MML组为过渡群体。门水平上，变形菌门（Proteobacteria）为绝对优势门，NH和MH组变形菌门丰度显著降低，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度增加。属水平上，NL组以肠球菌属（Enterococcus）和罗尔斯顿菌属（Ralstonia）为主，NH/MH组以假单胞菌属（Pseudomonas）和希瓦氏菌属（Shewanella）为主，ML组形成独立优势属。LEfSe差异物种分析显示各组富集了独特的标志性生物标志物，差异物种涵盖从门到属的多个分类水平。代谢通路分析表明N/MP暴露对肠道微生物代谢功能无显著影响（P>0.05）。

**讨论**

N/MPs在叶尔羌高原鳅体内的积累呈现粒径依赖性组织趋向性：小粒径NPs可穿透皮肤上皮细胞间隙进入皮下肌层，其巨大比表面积产生高氧化反应活性，引发表皮空泡化、黑色素细胞损伤及组织坏死，体现渗透性纳米毒性；1 μm MPs无法穿过皮肤上皮屏障，摄入后滞留肠腔，蠕动过程中的持续机械摩擦撕裂微绒毛，导致上皮脱落和组织溶解，体现机械磨损毒性。鳃组织中N/MPs的特异性高积累可归因于其单层呼吸上皮细胞间隙较大，有利于纳米颗粒穿透，而肠黏膜具有致密黏液屏障和蠕动加速塑料排泄。塔里木河低水量和弱稀释能力提高了N/MP暴露负荷，高原鱼类在缺氧条件下维持的高呼吸频率进一步增加了塑料颗粒与鳃组织的接触概率。N/MP暴露诱导的氧化应激表现为ROS过度产生、SOD和CAT代偿性升高以清除ROS、MDA降低反映脂质过氧化产物的极度消耗，以及AChE活性异常表明神经毒性损伤。值得注意的是，MP处理组α多样性的升高不应解释为肠道健康的改善：高MP应激下多样性的增加源于机会性致病菌和耐胁迫类群的增殖而非有益共生菌群，属于病理性应激反应。粒径决定了两种核心毒性途径——NPs的纳米毒性（强穿透性和高表面反应活性）与MPs的机械磨损毒性——共同调控组织积累、病变类型、抗氧化防御激活和肠道菌群扰动。

**结论**

本研究系统阐明了N/MPs对中国干旱区高原叶尔羌高原鳅的多维毒性效应：N/MPs在前14天于鳃和肠道快速积累，21天后鳃积累量（23.10 μg/g）超过肠道（17.90 μg/g）；组织损伤和氧化应激呈浓度依赖性模式（与粒径负相关），肠道、鳃和肝脏SOD活性升高40%–70%，MDA水平显著降低，第14天肠道AChE上调而第7天高浓度NP暴露短暂抑制肝脏AChE；N/MPs显著重塑肠道微生物群，MMH组α多样性升高而MH和NH组抑制丰富度、均匀度和系统发育多样性，变形菌门减少伴厚壁菌门和拟杆菌门增加，但预测代谢通路保持稳定，表明功能恢复力。与以往针对平原和海洋鱼类的单一粒径或单一剂量研究相比，本研究首次结合两种粒径与四个浓度梯度，将鳃优势塑料积累与高原缺氧适应相联系，揭示了粒径依赖性双重毒性机制。鉴于原始微球、21天单一污染物实验设计及缺乏恢复实验的局限性，本研究的生态风险推断应谨慎解读，不宜过度外推至野外实际场景；未来需结合环境风化N/MPs、慢性及复合污染物暴露、暴露后恢复实验和野外调查以建立种群风险阈值。