多模态无标记成像在骨发育及人类骨病研究中的应用：整合SHG、CARS与双光子自发荧光的创新平台

《Scientific Reports》：Application of multiphoton label-free imaging to phenotype bone development and bone pathologies

　　

摘要

长骨（如股骨）通过软骨内骨化（EO）发育，在此过程中，软骨通过一系列细胞事件逐渐被矿化骨取代。研究骨发育过程的传统成像方法要么需要使用外源染料/标记物，要么涉及电离辐射，这限制了其在体内的应用。多光子显微镜提供了一种无标记、非电离、具有高化学灵敏度的实时组织分析方法。本研究展示了整合多模态成像平台的新颖应用，该平台结合了二次谐波产生（SHG）、相合反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双光子自发荧光（2-PaF），用于研究骨发育和疾病。通过将多模态方法应用于三个发育阶段的小鸡胚胎股骨，我们揭示了与骨骼成熟相关的胶原表型变化，并展示了其识别与人类骨病相关的结构和生化改变的潜力。SHG能够对胶原纤维结构进行详细表征，此外，调谐至2845 cm?1拉曼谱带的CARS成像（对应中性脂质的对称CH?伸缩振动）识别出了与细胞内脂滴一致的富含脂质的结构。这些结构被认为是发育中骨皮质内的细胞成分，这一解释得到了染色结果的支持，染色结果显示细胞核密度在不同发育阶段间的定量变化趋势相当。2-PaF主要被纳入以展示系统的多模态成像能力，并通过基于内源自发荧光的可视化提供组织形态的总体概览。SHG分析显示胶原纤维数量/mm2和平均纤维长度逐渐增加，而纤维直度呈下降趋势，随后趋于稳定，无显著变化。相比之下，平均纤维宽度在D11和D14之间增加，此后趋于平稳。总体而言，CARS成像显示脂滴/mm2逐渐减少，这与骨成熟过程中细胞组成的动态变化一致。为探索该方法的转化应用性，SHG成像被应用于少量骨关节炎（OA；n?=?3）和骨质疏松症（OP；n?=?3）患者的人类骨芯活检样本。初步的定性观察显示样本间胶原组织存在明显差异，凸显了SHG成像在检测骨基质结构变化方面的潜力。尽管这些发现具有描述性和探索性，但多模态无标记成像在人类骨组织中的成功应用为未来研究骨骼组织成熟、基质重塑、再生疗法和组织工程策略奠定了基础。