分离质量因子作为液相色谱中方法筛选和色谱柱比较的工具

《Journal of Chromatography A》：Separation quality factor as a tool for method screening and column comparison in liquid chromatography

　　• 分离质量因子（SQF）被用作预测响应函数。
• SQF 热图有助于色谱方法的筛选。
• SQF 图谱能够识别共洗脱区域和洗脱顺序的反转。
• SQF 差异图谱可以直接比较色谱柱的性能。

**引言**
高效液相色谱（HPLC）被广泛认为是表征和定量简单及复杂基质中化合物的金标准。HPLC 在制药分析领域尤其适用 [1,2]。由于存在基于疏水性、大小、电荷或极性的各种色谱模式，HPLC 成为分析小分子和大生物分子的参考工具，包括下一代生物制药产品 [2,3]。

**方法开发**
方法开发（包括筛选和优化）是色谱分析师最重要的任务之一，他们需要通过研究各种参数（如固定相化学性质、流动相组成、梯度曲线和温度）来确定最佳条件。已经提出了多种方法开发方法。最简单的方法是一次改变一个参数（OFAT）的程序，即分别改变每个参数（例如梯度条件、pH 值、温度、有机修饰剂和固定相化学性质）。然而，这种方法可能非常耗时且繁琐，因为可测试的组合数量几乎无限。另一种方法是实验设计（DoE），通过在建模不同条件下的化合物行为来减少所需的实验次数 [4,5]。尽管这种方法需要的实验较少，但仍然可能耗费时间。它可以使用通用的 DoE 软件包（如 Statistica (Tibco)、JMP? (JMP Statistical Discovery LLC)、MODDE? (Sartorius) 或 Minitab? DOE (Effex) 以及更专门的色谱软件（如 Fusion? QbD (S-Matrix)）来实现 [6,7]。

**高效液相色谱的应用**
高效液相色谱（HPLC）在表征和定量简单及复杂基质中的化合物方面被广泛认可为黄金标准。HPLC 在制药分析领域特别适用 [1,2]。得益于基于疏水性、大小、电荷或极性的不同色谱模式，HPLC 是分析小分子和大生物分子（包括下一代生物药品）的常用工具 [2,3]。

**方法开发中的挑战**
方法开发，包括筛选和优化，是色谱分析师最重要的任务之一。他们必须通过研究各种参数（如固定相化学性质、流动相组成、梯度曲线和温度）来确定最佳条件。已经提出了多种方法开发方法。最简单的方法是一次改变一个参数（OFAT）的程序，即分别改变每个参数（例如梯度条件、pH 值、温度、有机修饰剂和固定相化学性质）。然而，这种方法可能非常耗时且繁琐，因为可测试的组合数量几乎无限。另一种方法是实验设计（DoE），通过在建模不同条件下的化合物行为来减少所需的实验次数 [4,5]。尽管这种方法需要的实验较少，但仍然可能耗费时间。它可以使用通用的 DoE 软件包（如 Statistica (Tibco)、JMP? (JMP Statistical Discovery LLC)、MODDE? (Sartorius) 或 Minitab? DOE (Effex) 以及更专门的色谱软件（如 Fusion? QbD (S-Matrix)）来实现 [6,7]。

**高效液相色谱的应用**
高效液相色谱（HPLC）在表征和定量简单及复杂基质中的化合物方面被广泛认可为黄金标准。得益于基于疏水性、大小、电荷或极性的不同色谱模式，HPLC 是分析小分子和大生物分子（包括下一代生物药品）的常用工具 [2,3]。

**保留模型在方法开发中的应用**
最有效的方法之一是使用已建立的色谱模型（如线性溶剂强度模型（LSS）、化学计量置换模型（SD）或 Neue-Kuss 模型等进行保留建模 [8]。由于色谱行为可以用数学公式描述，因此只需通过几次初始实验即可校准这些模型，从而优化梯度条件、温度和 pH 值 [8]。这种方法在 HPLC 建模软件（如 DryLab? (Molnar Institute) 或 ChromSword? Developer (ChromSword)）中得到实现，并且可以从仅 12 次初始实验中同时优化三个变量 [9]。由于设计空间涵盖了广泛的变量值，实验设计和保留建模不仅可以找到一个可接受的但不是最优的解决方案，还可以找到最佳分离条件。值得注意的是，实验设计和保留建模在质量源于设计（QbD）的背景下得到广泛应用 [10,11]。

**其他方法**
除了这些主要的方法开发策略外，还提出了一些不太常见的方法。其中之一是预测性洗脱窗口扩展（PEWS2），这是一种相对通用的梯度优化策略 [12]。在该策略中，算法通过在时间轴的不同部分系统地移动和扩展洗脱窗口来搜索色谱参数空间。分子描述符和定量结构-保留关系（QSRR）模型的使用也变得越来越流行 [13,14]。这些方法旨在快速开发方法并在不进行实验的情况下预测化合物的保留时间，仅依赖于分析物的理化性质。虽然这些方法很有前景，但预测的质量仍然不足，尤其是在分析密切相关的化合物时。

**机器学习在保留预测和优化中的应用**
最近，基于机器学习的保留预测和优化方法越来越受到关注 [15, [16], [17], [18]]。在这种全自动策略中，每个新实验都是根据之前实验的结果由算法选择的，直到达到满意的分离效果 [19]。尽管这种方法通常比保留建模（即半经验模型）需要更多的实验，但它对于高度复杂的混合物特别有用，因为基于机器学习的方法不需要识别单个峰。

**未来展望**
除了基于机器学习的优化外，近年来活跃学习工作流、贝叶斯优化、强化学习和不确定性驱动的实验设计在色谱方法开发方面也取得了快速发展 [20,21,22]。这些方法旨在最大化从每次实验中获得的信息并减少所需的实验次数。虽然这些方法的目标与本研究不同，但它们都依赖于适当的响应函数来评估色谱性能，突显了可靠的全局分离质量指标的重要性。可以考虑多种响应函数来评估 HPLC 分离的质量。官方指南和药典文本（包括欧洲药典 (EP)、美国药典 (USP) 和国际协调理事会 (ICH) 的规定）要求对色谱性能进行评估，以确保分析结果的可靠性。经典的色谱指标包括效率（板数 N）、选择性（α）、分辨率（Rs）、峰宽（w）、保留因子（k）、理论板高度当量（HETP）或峰谷比。

**综合评价方法**
尽管所有这些指标都很有用，但单一的色谱指标无法完全描述分离的质量，因为色谱是一个本质上的多变量问题。例如，一种方法可能提供出色的分辨率，但分析时间过长。因此，色谱分析师开发了全局质量描述符，这些描述符是数学函数，能够将多个目标综合到一个分数中。在这种情况下，引入了组合指标的概念，如色谱响应函数（CRFs）或色谱优化因子（COFs）。这些概念源自近 50 年前 Carr 的开创性工作，他提出了一个惩罚分辨率不足和保留时间过长的客观函数 [23]。随后，Glajch 将这一概念扩展到梯度洗脱模式，引入了同时考虑关键对分辨率、总运行时间和峰间距的加权函数 [24]。这种策略在制药分析和自动化方法开发中变得非常有价值。Duarte 提出了更复杂的多标准优化策略，对于方法优化非常有用 [25]。最近，人们对 CRFs 的兴趣持续增长，重点在于改善竞争分离目标之间的平衡并减少用户对加权程序的干预。例如，提出了自适应加权方法，根据分离问题的特点自动调整各个色谱标准的相对重要性 [26]。同样，对色谱响应函数的比较评估突出了不同客观函数公式在自动化方法优化中的优势和局限性 [27]。这些发展进一步强调了可靠且适用于广泛情况的响应函数在色谱决策中的重要性。

**结论**
总体而言，这些方法通过同时考虑多个约束条件，提供了更真实的分离质量评估。它们还利用专用软件促进了自动化优化，并改善了决策过程。色谱分析师可以使用单一分数客观地对方法进行排序，而无需手动检查数十张色谱图。然而，这些方法也存在一些局限性。特别是，具有不同维度的参数经常被组合在一起（例如分辨率和分析时间），而且变量通常没有标准化。因此，跨不同色谱条件的比较仍然困难，定义一个真正的“全局最优”仍然具有挑战性。

**新指标的开发**
为了克服这些局限性，我们最近开发了一种新的指标，它将五个标准化和无量纲的子指标整合为一个单一的标准化值 [28]。该指标通过惩罚宽峰、峰不对称性、不均匀的峰间距、洗脱窗口利用不足以及共洗脱或不当的洗脱顺序，提供了对色谱分离的稳健、客观和可扩展的评估。分离质量因子（SQF）适用于各种色谱模式，使其比之前的指标更具通用性。因此，它既适用于手动决策，也适用于自动化优化工作流程 [28,29]。

**基于 SQF 的新方法开发策略**
在这项工作中，我们提出了一种新的方法开发策略，以 SQF 作为响应函数，并依赖于三次输入校准实验。这种新策略能够在校准的设计空间内高精度地预测整体分离质量。据我们所知，这是第一项描述这种多响应优化程序的研究，其中同时监测和可视化了五个单独的标准化指标的组合。所提出的 SQF 可以视为一种特定类型的 CRF，因为它将多个色谱描述符结合成一个优化标准。然而，与大多数先前报告的 CRF 不同，SQF 仅由标准化和无量纲的子指标构建。其目的不仅是对色谱方法进行排名，还提供了适用于不同色谱模式和样品的通用分离质量描述。从这个意义上说，SQF 代表了一种专为色谱性能评估和方法优化设计的通用化标准化 CRF 形式。

**方法筛选和计算程序**
本工作采用了一种基于三个实验的简化角点校准策略，在受限的设计空间内参数化保留时间、峰宽和峰对称性。虽然一些现代保留建模方法也可以从类似的少量校准数据集中获得准确的预测，但本研究的目的不是开发新的保留建模方法，而是展示 SQF 作为方法筛选和柱性能评价的响应函数。

**指标灵敏度**
为了了解每个标准化描述符对整体 SQF 的贡献，我们研究了 SQF 对其组成部分的数学灵敏度。SQF 被定义为这五个指标的几何平均值：SQF = (ηSDUrWeCPOmin)^1/5。因此，每个参数的贡献本质上是非线性和乘法的。这种结构确保没有任何一个指标能够完全弥补另一个指标的性能不足，任何子指标的退化都会影响最终得分。

**结论**
在这项工作中，我们展示了一种基于分离质量因子（SQF）的色谱方法筛选和柱分析比较的新策略。这是首次将 SQF 不仅作为评估指标，还作为从保留建模中得出的预测响应函数来应用。所提出方法的一个关键优势是使用了简化的建模策略来预测峰属性。这些预测属性被成功用于重建色谱行为。

**作者贡献声明**
Mathias Buff：方法论、概念化。Davy Guillarme：写作-审稿与编辑、监督。Róbert Kormány：研究、数据管理。Szabolcs Fekete：写作-初稿、方法论、研究、概念化。