超声辅助冷冻对即食海参贮藏期间理化特性及胶原品质的多尺度影响评价

《Journal of Agriculture and Food Research》：Evaluating the effects of ultrasound-assisted freezing on the physicochemical properties and collagen quality of ready-to-eat sea cucumbers during storage

　　

本研究系统考察了低温快速冷冻（LQF，Low?temperature quick freezing）、低电压静电场辅助冷冻（LVEF，Low voltage electrostatic field assisted freezing）和超声辅助冷冻（UAF，Ultrasound?assisted freezing）对即食海参（RSC，Ready?to?eat sea cucumbers）冷冻贮藏期间品质的调控作用。UAF处理显著加快了冷冻速率，缩短了通过最大冰晶生成带所需的时间，并在贮藏3个月后有效保持了质构特性、持水性（WHC，Water holding capacity）和微观结构完整性。此外，UAF处理显著抑制了胶原氧化，表现为较低的羰基含量、较高的巯基水平以及减少的二酪氨酸生成，同时增强了胶原稳定性，这体现在较高的溶解度、较低的浊度、较小的粒径以及α?螺旋（α?helix）结构的更好保持。相比之下，LQF处理由于冷冻速率较慢，导致了严重的冰晶损伤、胶原氧化和结构破坏。总体而言，UAF是改善富含胶原蛋白的水产冷冻产品品质的一种有前景的策略。冷冻成本是任何技术商业化的核心考量，然而目前对UAF经济可行性的系统研究仍十分有限。

**【研究背景与目的】**
海参（Apostichopus Japonicus）是一类高蛋白、富含胶原蛋白及多种生物活性物质的珍贵海洋资源。即食海参（RSC，Ready?to?eat sea cucumbers）作为重要的消费形态，市场份额持续扩大。然而，海参体壁在常温或冷藏（4?°C）条件下极易发生品质劣变，因此冷冻贮藏成为延长货架期的关键手段。体壁干重中约70%为胶原蛋白，其分子结构和组成直接决定产品的质构与整体食用品质。常规冷冻往往形成大而不规则的冰晶，破坏体壁致密的胶原网络，加速水分流失，导致解冻后质构崩塌。冰晶尺寸、形态和空间分布是决定冷冻食品品质的核心因素，慢速或不可控的冷冻会引发冰晶生长和重结晶，造成不可逆的组织损伤和蛋白变性。因此，精确调控冷冻过程中的冰核化和晶体生长对维持水产品的结构完整性与品质至关重要。

低温快速冷冻（LQF，Low?temperature quick freezing）虽可促进成核，但产品内部仍易产生温度梯度，导致冰晶分布不均，局部损伤富含胶原的组织。近年来，超声辅助冷冻（UAF，Ultrasound?assisted freezing）和低电压静电场辅助冷冻（LVEF，Low voltage electrostatic field assisted freezing）等物理场辅助技术因能够调控冰晶形成而备受关注。UAF通过超声空化效应和机械效应增强冰核化，促使生成更细小、分布更均匀的冰晶；LVEF则借助静电场影响水分子取向，形成较小分子团簇而抑制冰晶生长。然而，迄今尚无研究系统比较UAF和LVEF对海参胶原特性及整体产品品质的影响。为此，本研究旨在系统评价LQF、LVEF和UAF三种冷冻方式对即食海参在冷冻贮藏期间品质演变的影响，通过综合分析理化性质、微观结构以及胶原氧化、降解和构象变化，为RSC行业冷冻技术的优化提供理论依据。

**【主要技术方法概要】**
研究以表面完整、大小相近（15?±?1?g）的盐渍仿刺参为原料（大连食品公司），经去内脏、脱盐、90?°C煮沸1.5?h和4?°C纯水浸泡72?h制得RSC。分别实施三种冷冻处理：LQF（鼓风冷冻至?30?°C）、LVEF（LQF基础上叠加2500?V/m静电场）和UAF（200?W、25?kHz超声辅助，95%乙醇循环制冷至?30?°C）。所有样品于?18?°C恒温冰箱贮藏0、1、2、3个月，4?°C解冻12?h待测。分析技术包括：温度传感器记录中心温度-时间冷冻曲线；质构剖面分析（TPA）测定硬度、内聚性、咀嚼性；称重法测定解冻损失、离心损失和蒸煮损失以评估持水性（WHC）；低场核磁共振（LF?NMR）T₂弛豫曲线与磁共振成像（MRI）表征水分状态与空间分布；苏木精?伊红（HE）染色光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察微观结构；提取体壁胶原后分别测定氧化标志物（羰基含量、总巯基含量、二酪氨酸）、变性参数（溶解度、浊度、表面疏水性、粒径）、降解标志物（游离羟脯氨酸FHYP、游离氨基氮FAN、赖氨酸侧链ε?氨基含量）、二级结构（傅里叶变换红外光谱FT?IR酰胺I带高斯拟合）、三级结构（内源荧光光谱）及蛋白网络（激光扫描共聚焦显微镜LSCM）。数据统计采用SPSS单因素方差分析和Duncan多重比较。

**【主要研究结果】**

**3.1 理化性质分析**
**3.1.1 冷冻曲线：** 冷冻过程可分为预冷（4?°C→?1?°C）、相变（?1?°C→?5?°C，即最大冰晶生成带，约80%水分相变）和深冷（?5?°C→?18?°C）三个阶段。UAF和LVEF均显著缩短了最大冰晶生成带的停留时间，其中UAF仅需3.18?min，LVEF为3.88?min，均短于LQF的5.75?min，表明UAF冷冻效率最高，主要归因于超声空化增强传热并促进冰核化。作者指出UAF采用乙醇制冷剂与LQF/LVEF的空气冷冻介质存在传热系数差异，未来须统一介质以分离超声特异性效应。
**3.1.2 质构：** 随贮藏延长，各组硬度和咀嚼性均显著下降（P?**3.1.3 持水性：** 解冻损失、离心损失和蒸煮损失均随贮藏时间增加而升高，但UAF组始终最低。3个月时UAF解冻损失18.67%，显著低于LQF的22.29%；离心损失UAF为25.29%，LQF为28.13%；蒸煮损失UAF为10.06%，LQF为11.38%。UAF优异的持水性归因于细小均匀冰晶减少了细胞损伤和水分迁移。
**3.1.4 水分状态与分布：** LF?NMR显示RSC中存在结合水T₂₁、不易流动水T₂₂和自由水T₂₃三种水分，其中T₂₃占主导。贮藏期间各组T₂₂和T₂₃峰均发生时间依赖性右移，峰面积略有减小，表明水流动性增加；LQF组变化最显著，反映出最严重的水分迁移。MRI伪彩图中，UAF组体壁信号强度高且分布均匀，表明质子密度大、保水性好；LQF组则呈现暗区和信号不均，提示冰晶损伤导致的严重失水。
**3.1.5 微观结构：** 光学显微镜HE染色图像中白色区域为冰晶造成的组织孔隙。LQF组出现大量大空洞，结构完整性差；UAF组贮藏1个月后仍保持相对完整致密的微观结构，LVEF组呈中度疏松；3个月后LQF组广泛出现裂隙和松散结构，UAF仍维持较好的完整性。SEM照片进一步显示，UAF组表面光滑，胶原纤维排列紧密，孔隙细小；LQF组表面粗糙，孔隙大，纤维断裂严重。UAF有效抑制了冰晶生长，保护了微观结构稳定性。

**3.2 胶原氧化分析**
**3.2.1 羰基含量：** 各组羰基含量随贮藏持续上升。3个月时UAF为12.86?nmol/mg，LVEF为13.03?nmol/mg，LQF高达14.95?nmol/mg。LQF较慢冷冻速率促进冰晶粗化和重结晶，加重蛋白机械损伤，使氧化敏感氨基酸残基暴露于冰晶界面和氧化微环境，导致羰基大量形成；UAF则通过减轻结构损伤和抑制氧化剂局部积累，显著抑制羰基生成。
**3.2.2 总巯基含量：** 0?月时各组无显著差异；3个月时UAF巯基含量最高（15.75?nmol/mg），LQF最低（13.51?nmol/mg）。LQF中大而不均匀冰晶破坏疏水环境，促进分子氧渗入蛋白内部，加速巯基（?SH）氧化为二硫键（?S?S?）；UAF限制氧化剂对巯基的可及性，有效保护了巯基。
**3.2.3 二酪氨酸：** 二酪氨酸相对荧光强度随贮藏增加，LQF组自1个月起即显著高于UAF和LVEF组（P?
**3.3 胶原变性分析**
**3.3.1 溶解度：** 贮藏3个月后UAF溶解度最高（73.82%），LVEF次之（71.53%），LQF最低（68.03%），差异显著。UAF较快的冷冻速率减轻了蛋白物理损伤和氧化程度，保持了较高溶解度；LQF大冰晶造成不可逆结构损伤和蛋白聚集，致使溶解度下降最甚。
**3.3.2 浊度：** UAF组浊度始终最低，3个月时为0.63 NTU；LQF组最高，达0.76 NTU。LQF慢速冷冻使水分逐渐迁移至胞外，破坏蛋白?水氢键网络，加强蛋白?蛋白相互作用，形成大量不溶性聚集体；UAF则减少聚集沉淀，维持了溶液体系的均一透明。
**3.3.3 表面疏水性：** 各组表面疏水性均随贮藏下降，但UAF下降最慢。3个月时UAF为14.82?μg，显著高于LVEF（11.53?μg）和LQF（11.03?μg）（P?**3.3.4 粒径：** 所有处理组粒径均随贮藏增大，UAF组粒径最小。冷冻破坏胶原网络，生成的小分子片段再聚集，同时暴露的内部疏水基团通过疏水作用、氢键等引发蛋白聚集和构象重排，致使粒径增大。UAF最大程度地减轻了这些变化。

**3.4 胶原降解分析**
**3.4.1 游离羟脯氨酸（FHYP）：** FHYP是胶原降解的核心标志物。3个月时LQF组FHYP增幅最大（+41.92?μg/g），UAF组增幅最小（+32.8?μg/g），LVEF居中（+33.91?μg/g）。UAF和LVEF均显著延缓了胶原降解，UAF效果更优，与其快速冷冻减轻冰晶对胶原纤维的损伤并抑制胶原酶活性密切相关。
**3.4.2 游离氨基氮（FAN）：** FAN含量随贮藏持续上升，LQF组始终显著高于其他两组（P?**3.4.3 赖氨酸侧链ε?氨基：** ε?氨基含量随贮藏总体呈上升趋势，表明降解反应占主导而非交联。3个月时LQF组ε?氨基含量最高（8.92?μmol/g），UAF组最低（7.18?μmol/g），印证UAF处理下蛋白降解程度最轻，结构完整性保持最好。

**3.5 胶原构象分析**
**3.5.1 二级结构：** FT?IR酰胺I带（1700?1600?cm^?1）高斯拟合显示，贮藏3个月后UAF组α?螺旋含量最高（44.90%），β?折叠最低（29.04%），表明天然二级结构保持最优；LQF组α?螺旋最低（38.36%），β?折叠（31.64%）和无规卷曲（14.37%）最高，提示严重变性。UAF更好维持了稳定α?螺旋的氢键网络，抑制了向β?折叠的转变（蛋白去折叠和聚集的标志）。
**3.5.2 内源荧光光谱（三级结构）：** 初始时各组光谱几乎重叠，最大发射波长λ_max均为322?nm，强度4116?a.u.。3个月后UAF组荧光强度最高（3265?a.u.），λ_max仅红移2?nm，表明色氨酸（Trp）残基疏水微环境保护良好；LVEF组红移4?nm，强度降至3130?a.u.，提示部分结构松散；LQF组红移8?nm，强度最低（3000?a.u.），反映严重构象紊乱和蛋白去折叠，可能伴随聚集。UAF通过调控冰晶成核和生长，最大限度维持了胶原三级结构的完整性。
**3.5.3 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）分析：** UAF组呈现完整连续的蛋白网络，荧光分布均匀；LVEF组相对均一但可见局部聚集；LQF组荧光高度不均，蛋白聚集显著，网络结构严重破坏。UAF的超声空化和声微流促进了成核、减小了冰晶尺寸，有助于稳定蛋白网络并提高持水性。

**3.6 UAF保护胶原品质的机制总结**
UAF对胶原的保护效应源于“冰晶调控?氧化抑制?构象稳态”的级联机制。其核心热力学作用是缩短最大冰晶生成带停留时间，生成更细小、更均匀的冰晶，从物理层面减轻对胶原纤维网络的不可逆穿刺和挤压。宏观结构完整性的保持构成限制后续化学损伤的前提——物理损伤减轻后，从受损细胞区室释放的促氧化金属离子和自由基的局部积累受到遏制。同时，紧密的螺旋构象在空间上保护了蛋白酶敏感位点和易聚集疏水区域，从而改善溶解性、降低浊度和粒径。构象稳定性进一步延迟了变性驱动的聚集以及酶解/水解所致降解，这被较低的FHYP和FAN水平所证实。上述层次化保护效应最终体现为质构、持水性和微观结构稳定性的全面提升。UAF从本质上减轻了冷冻胁迫的物理强度，而非改变胶原的内在化学耐受性，从而构建了从物理调控到生化保护的保护性级联。

**【研究结论】**
本研究系统考察了LQF、LVEF和UAF对即食海参冷冻贮藏期间品质的调控作用。UAF处理显著加速了冷冻过程，缩短了通过最大冰晶生成带所需的时间，并在贮藏3个月后有效保持了质构特性、持水性和微观结构完整性。同时，UAF处理显著抑制了胶原氧化，表现为较低的羰基含量、较高的巯基水平以及减少的二酪氨酸生成，并增强了胶原稳定性，这体现在较高的溶解度、较低的浊度、较小的粒径以及α?螺旋结构的更好保持。相比之下，LQF处理因冷冻速率较慢而导致严重的冰晶损伤、胶原氧化和结构破坏。总体而言，UAF是改善富含胶原蛋白的水产冷冻产品品质的一种有前景的策略。冷冻成本是任何技术商业化的核心考量因素，但目前对UAF经济可行性的系统研究仍十分有限。