衰老皮肤创面愈合增强的分泌组与生物活性分子：从分子机制到细胞外囊泡及智能递送策略

《Ageing Research Reviews》：Secretome and Bioactive Molecules for the Enhancement of Aged Wound Healing

　　

摘要专业翻译 氧化应激、炎症和细胞衰老损害了衰老皮肤的创面愈合。基于分泌组的疗法为慢性创面提供了一种有前景的无细胞策略。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）和微小RNA（microRNAs，miRNAs）可作为衰老皮肤再生的强效治疗工具。智能递送平台能够实现适应年龄的创面治疗性释放。

论文主体内容总结

1. 皮肤衰老机制与创面愈合

衰老是一个涉及多个生物学尺度进行性功能衰退的复杂生理过程。在皮肤中，这一过程表现为形态、表型和功能上的改变。内在因素为这些反应设定了基线，例如绝经后雌二醇水平下降会损害皮肤结构、屏障功能和脂质组成，导致弹性降低和粘弹性形变增加。此外，遗传变异可部分解释皮肤衰老的个体间差异，如丝聚合蛋白原合成基因FLG的功能缺失突变会直接损害角质层形成并增加经皮水分丢失。

皮肤衰老由细胞稳态的进行性破坏驱动，这些破坏直接损害组织修复能力。氧化应激是这一恶化的核心，衰老皮肤与年轻皮肤相比抗氧化能力下降，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）从外源性因素（如无防护的紫外线暴露）和内源性因素（包括线粒体功能障碍）中累积。衰老皮肤中运行的病理机制形成了一个自我强化的网络，有利于从瞬时损伤反应向慢性组织功能障碍的转变。氧化应激诱导DNA损伤、线粒体功能障碍以及p16/Rb和p53/p21通路的激活，从而促进细胞衰老。反过来，衰老细胞释放促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和基质重塑酶，这些物质维持慢性炎症、将衰老传播至邻近细胞并损害细胞外基质（extracellular matrix，ECM）稳态。ROS诱导的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达和胶原降解进一步破坏成纤维细胞-ECM机械转导和整合素信号传导。持续的低度炎症通过增加ROS产生和损害免疫介导的衰老细胞清除来强化这一循环。同时，组织灌注减少加剧了局部缺氧和代谢应激，进一步促进线粒体功能障碍、氧化损伤和炎症信号传导。

1.1. 核心信号网络的细胞类型特异性整合

皮肤衰老涉及的分子通路在不同细胞区室中并非均匀运作。尽管MAPK、NF-κB、STAT和KLF信号网络相互关联，但它们在角质形成细胞、成纤维细胞和血管细胞中的主要功能和病理后果有所不同。

在表皮角质形成细胞中，KLF转录因子构成上皮身份、自我更新和屏障维持的重要调控轴。年龄相关的KLF4、KLF5和KLF6下调减少基底角质形成细胞增殖，导致表皮稳态缺陷。MAPK/AP-1和NF-κB信号也调节角质形成细胞的应激、炎症和迁移反应，但持续激活可能促进损害角质形成细胞增殖和迁移的慢性应激程序。STAT3的瞬时激活支持角质形成细胞增殖和再上皮化，而衰老角质形成细胞中其激活不足与延迟创面修复相关。

在真皮成纤维细胞中，MAPK/AP-1信号的持续激活促进MMP表达和胶原降解，而NF-κB促进炎性细胞因子产生和衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）的建立。衰老还增加成纤维细胞转录异质性并改变肌动蛋白调节蛋白的表达，从而独立于增殖损害迁移和基质组织。此外，衰老成纤维细胞失去与未分化基底角质形成细胞的大部分配体-受体相互作用，破坏了维持表皮稳态所需的旁分泌通讯。

在内皮细胞中，MAPK和STAT信号通过支持增殖、迁移和新血管形成来促进血管生成反应。然而，慢性氧化应激和持续的NF-κB激活促进内皮炎症、功能障碍和衰老，降低血管细胞对促血管生成信号的响应性。衰老还与血管细胞密度降低以及成纤维细胞、内皮细胞和基底角质形成细胞之间JAG1-NOTCH3信号受损相关。

衰老还改变常驻免疫细胞群的丰度和功能。表皮朗格汉斯细胞因前体募集受损而逐渐耗竭，最终损害免疫监视和组织修复的协调。上真皮中毛细血管相关巨噬细胞因自我更新减少而随年龄逐渐丧失，损害吞噬碎片清除和微血管修复。

1.2. 慢性创面病因学中与年龄相关的愈合障碍

衰老并非一种独立的慢性创面病因，而是创造了一个生物学上脆弱的组织环境，使损伤反应逐渐受损。年龄相关的愈合障碍、糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers，DFUs）和静脉性腿部溃疡（venous leg ulcers，VLUs）在若干病理特征上趋同，包括持续炎症、氧化应激、细胞衰老、血管生成受损、过度蛋白水解活性和组织重塑缺陷。然而，这些机制在这些临床背景中的相对贡献和起始原因存在显著差异。

在DFUs中，年龄相关缺陷因慢性高血糖而加剧，高血糖促进氧化应激、内皮功能障碍和免疫反应受损。周围神经病变、重复性机械应力、外周动脉疾病和感染易感性增加进一步区分DFUs与年龄相关愈合障碍。相比之下，VLUs主要由静脉反流、梗阻或小腿肌肉泵功能障碍导致的慢性静脉高压驱动。这种血流动力学紊乱促进水肿、内皮激活、白细胞募集以及创面床内持续的炎症和蛋白水解活性。

2. 基于分泌组的衰老创面修复策略

分泌组是细胞释放到细胞外环境中的复杂生物活性因子库，已成为一种能够将衰老细胞重编程为促再生表型并恢复细胞间通讯的无细胞平台。通过利用生物活性旁分泌信号而非细胞本身，这些策略规避了细胞存活、植入和免疫原性的固有风险。此外，无细胞疗法在临床可扩展性方面具有优势，包括更精确的剂量控制、标准化处理、简化的长期储存以及需要重复给药的治疗方案的可行性。

在治疗方面，分泌组可以以整个条件培养基或选择性分离的组分形式给药。其中，EVs是研究最深入的组分，但非囊泡可溶性组分因其独特的再生和免疫调节特性也正在被探索。尽管大多数研究集中于间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）来源的分泌组，但其他细胞来源，包括免疫细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、胎盘来源细胞和诱导多能干细胞来源的MSCs，也产生具有再生潜力的生物活性组分。

分泌组通过四种汇聚机制作用于衰老创面微环境：抗氧化活性、抗衰老活性、免疫调节和血管生成。慢性激活MAPK和NF-κB等信号通路不仅驱动氧化应激，还使内源性分泌组环境不利于衰老皮肤的有效创面修复。分泌组还发挥强效的抗氧化和抗衰老作用，如绒毛膜来源干/基质细胞条件培养基通过EGF和TGF-β信号增强UV损伤表皮细胞的活力，同时降低ROS水平和DNA损伤。人真皮干/祖细胞分泌组通过抑制MMP-1表达、恢复I型、IV型和V型胶原以及增强TIMP1表达来对抗UVA诱导的真皮成纤维细胞损伤。此外，人脐带MSC分泌组显著减轻放射性溃疡，降低组织中p16、p21和p53的表达，减少促炎细胞因子IL-1α水平并恢复血管生成素-1血清水平。缺氧预处理的脂肪来源干细胞条件培养基通过增加VEGF水平和激活AKT、mTOR及MAPK信号通路促进衰老小鼠的血管生成并加速创面愈合。

2.1. 衰老组织微环境中的生长因子

生长因子是创面修复中研究最广泛且临床进展最快的无细胞治疗类别之一。然而，在衰老皮肤中，愈合受到信号分子/通路生物利用度受损和/或时空调节改变的阻碍。衰老皮肤显示关键生长因子如EGF和FGF-2水平显著降低。这种下降因慢性创面微环境而加剧，其中过度的蛋白酶活性（特别是升高的MMPs）降解生长因子和ECM组分，而受体下调和慢性低度炎症进一步损害细胞对修复信号的响应。

重组人EGF（rhEGF）已被广泛研究用于对抗年龄相关的创面愈合障碍。在临床环境中，rhEGF通过病灶内浸润给药于慢性足溃疡，通常每次25-75 μg，每周一次或两次，持续数周。在糖尿病足溃疡的随机对照试验中，局部rhEGF显著提高完全愈合率并加速创面闭合。FGF家族成员也在衰老和衰老相关创面环境中显示出治疗功效。在老年小鼠中，FGF-1局部给药显著改善增殖期愈合参数。PDGF因其促血管生成和促肉芽组织形成作用而被探索。重组人血小板衍生生长因子BB（rhPDGF-BB）是目前唯一获FDA批准用于组织再生和年轻化适应症的生长因子，Regranex?凝胶被批准用于促进下肢糖尿病神经性溃疡的皮肤创面愈合。

2.2. 细胞因子和趋化因子：重新平衡炎症微环境

从慢性炎症状态向再生阶段的转变由细胞因子和趋化因子的精细平衡协调，这一过程在衰老微环境中被根本性破坏。在炎症早期，巨噬细胞在创面部位积聚并采用促炎M1表型。这种持续激活最终变得适应不良，导致慢性升高的IL-1β、IL-12和TNF-α持续覆盖有效创面愈合所需的消退信号。从M1向M2表型的转变由STAT3激活等信号控制。M2巨噬细胞分泌IL-10和TGF-β等介质，这些介质对消退炎症和支持ECM重塑至关重要。

靶向促炎环境已显示出治疗前景。在糖尿病db/db小鼠中，创面后一小时单次病灶周围注射IL-1受体拮抗剂显著加速创面闭合。重组人IL-10在动物模型和健康志愿者中减少了炎症细胞浸润并改善了瘢痕外观。趋化因子在创面愈合中也发挥关键作用，协调免疫细胞向损伤部位的序贯募集。CXCL12通过CXCR4信号促进内皮祖细胞募集、巨噬细胞向修复表型极化和新血管形成。相反，清除过度表达的促炎趋化因子代表了一种替代策略，如基于糖胺聚糖的水凝胶创面接触层选择性隔离IL-8和MCP-1而不消耗促再生因子。

3. 细胞外囊泡作为分泌组驱动创面修复的核心介质

在分泌组的众多组分中，EVs作为无细胞再生疗法的关键介质受到广泛关注。这些小的脂质双层包裹颗粒（约20-1000 nm）运输受保护的生物活性货物，包括蛋白质、脂质和核酸，从而实现上下文依赖的细胞间通讯和组织稳态调节。此外，线粒体来源囊泡作为线粒体质量控制和细胞间代谢通讯的介质正在出现，但其在皮肤创面愈合中的作用仍 largely 未被探索。

MSC来源EVs的治疗效力来自其协调多种互补机制的能力：加速止血、重新平衡细胞因子谱以及驱动巨噬细胞向抗炎M2表型极化。MSC-sEV通过miR-146a的转移减轻氧化应激诱导的内皮细胞衰老，减少衰老标志物和SASP因子，同时通过抑制Src磷酸化增强血管生成。脂肪干细胞来源微囊泡通过激活AKT和ERK信号通路增强角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的增殖和迁移。iMSC来源EVs在糖尿病模型中表现出强效促血管生成作用，恢复光老化成纤维细胞中的胶原合成，并通过调节TGF-β2/Smad2通路改善再上皮化。

虽然天然EVs具有内在治疗价值，但工程化策略正越来越多地被应用以增强其分子货物和/或控制其靶向潜力。这可以通过预条件化分泌细胞（遗传和/或环境启动）或通过直接分离后修饰来实现。例如，miR-425-5p工程化EVs可改善糖尿病创面愈合，miR-17-5p工程化EVs封装在明胶甲基丙烯酰水凝胶中通过靶向PTEN和p21恢复皮肤修复细胞的增殖和迁移活性。尽管取得了这些进展，EVs基础疗法的临床转化仍受限于产品异质性、制造可扩展性有限以及剂量和给药途径依赖的生物分布。

3.1. 微小RNA

RNA-based调控机制，特别是由非编码RNA介导的机制，现被认为是皮肤修复的基本调节因子。这些分子控制炎症、再上皮化、血管生成、ECM重塑和组织再生。在各类别中，miRNAs是体细胞组织中研究最广泛的转录后调节因子。由于其多效性，单个miRNA可以调节创面愈合的多个阶段，其生物学影响根据局部代谢状态、炎症张力和细胞衰老的存在而变化。根据其作用，miRNAs可以通过恢复性策略（miRNA mimics）或抑制性方法（antagomirs或miRNA sponges）进行调节。