《Structure》：Cryo-electron tomography of functionally validated synapses in human induced neurons
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冷冻电镜断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）为突触结构研究提供了前所未有的认知，然而其在人类神经元中的应用一直受限于样品制备的挑战。研究人员在此建立了一个集成平台，该平台将在电子显微镜（electron microsco
冷冻电镜断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）为突触结构研究提供了前所未有的认知，然而其在人类神经元中的应用一直受限于样品制备的挑战。研究人员在此建立了一个集成平台，该平台将在电子显微镜（electron microscopy，EM）载网上直接培养的人诱导神经元（human induced neurons，iNs）与功能性电生理验证及cryo-ET成像相结合。人iNs在EM载网上形成了广泛的神经元网络，表现出可靠的突触传递和内在兴奋性，并维持了短时程突触可塑性。虽然iNs在EM载网上表现出完整的突触传递，但研究人员发现EM载网对细胞外电刺激起到了电流汇（current sink）的作用。在玻璃化后，cryo-ET能够直接可视化兴奋性突触的超微结构特征，包括突触囊泡池（synaptic vesicle pools）、活性区近端囊泡（active zone proximal vesicles）、突触后致密区（postsynaptic densities）及相关细胞器。综上所述，研究结果为人iNs之间突触组织的结构与功能解析奠定了基础，并为干细胞衍生的人神经元突触的cryo-ET成像提供了初步见解。
**人诱导神经元突触的冷冻电镜断层扫描结构与功能联合解析**
**一、研究背景与科学问题**
化学突触是高度特化的细胞通讯连接结构，其分子组织介导了高保真的神经传递和突触可塑性。冷冻电镜断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）已成为在近天然状态下可视化突触的强大技术手段，能够提供关于突触囊泡组织、活性区结构和跨突触组装体的纳米级分辨率见解。然而，迄今为止，大多数突触的cryo-ET研究仅限于啮齿动物神经元或非人类来源的神经元培养体系，限制了对人类突触超微结构的直接研究。
由人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）或诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）生成的人诱导神经元（human induced neurons，iNs）在生物医学研究中被广泛使用。转录因子neurogenin-2（Ngn2）的过表达能够实现hESCs向相对均一的兴奋性神经元群体的快速高效分化。这些iNs能够形成功能性突触，表现出稳健的自发性和诱发性突触传递，为在人类细胞背景下研究突触功能和可塑性提供了易处理的系统。结合CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，hESC和iPSC来源的神经元能够实现精确的遗传操作，用于人类疾病建模。尽管已有初步的cryo-ET研究开始探索人类神经元来源系统中的亚细胞和突触组织，但在人类神经元衍生系统中对突触超微结构特征的定量分析仍然有限，尤其是在直接培养于冷冻电镜载网上并经功能验证的培养体系中。
尽管人类神经元系统在cryo-ET应用中前景广阔，但仍存在重大技术挑战。人iNs必须在EM载网上直接培养超过1个月，保持功能性突触活性，并与快速玻璃化和功能分析相兼容。载网上生长神经元的电生理验证以及EM载网上突触功能与载网外突触的比较，在结构研究中仍未得到充分应用。因此，来源于hESCs的人类神经元的突触超微结构和功能在很大程度上仍未被探索。
**二、研究内容与结论**
研究人员建立了一个集成工作流程，将直接在冷冻电镜载网上培养的人iNs与电生理记录及后续cryo-ET分析相结合。通过这一方法，研究证明了载网上生长的人iNs能够形成与载网外对照相当的功能性突触，并适用于高分辨率cryo-ET成像。该平台实现了人iNs中突触结构的直接可视化，为人类iNs突触的结构-功能联合研究提供了关键基础。
研究人员首先优化了基于载网的培养方案，整合了原代神经元在EM载网上培养的成熟方法和人iN培养体系。人iNs通过多西环素诱导的Ngn2表达从多能干细胞分化而来，经嘌呤霉素筛选获得纯化的iN群体。为促进载网上神经元的存活和成熟，使用原代小鼠胶质细胞作为饲养层提供营养支持。将EM载网直接置于汇合的胶质单层上方再进行神经元接种，使人iNs附着于载网表面并跨载网孔延伸突起。这一构型同时降低了载网表面的细胞密度，增加了玻璃化后可视化突触的概率，同时保持了来自下方胶质饲养层的功能支持。在体外培养40天时，载网上和载网外人iNs均形成了跨越多个载网方格的致密互联网络。
为确定在冷冻电镜载网上培养人iNs是否改变突触功能，研究人员对位于载网上（ON-grid）和同一盖玻片上载网区域外（OFF-grid）的iNs进行了全细胞膜片钳记录。自发兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs）在ON-grid和OFF-grid iNs中均可检测到，频率和幅度无显著差异，sEPSC上升和衰减动力学也相当。诱发性兴奋性突触后电流（evoked excitatory postsynaptic currents，eEPSCs）在两种条件下均可可靠引出，但ON-grid神经元的eEPSC峰值幅度小于OFF-grid神经元，这可能与载网培养刺激相关的电紧张特性差异有关。尽管eEPSC幅度存在差异，20 Hz配对脉冲刺激产生了相当的配对脉冲比率，表明突触前释放概率未因在EM载网上生长而改变。此外，ON-grid和OFF-grid神经元在重复刺激后表现出相似程度的短时程突触抑制，表明囊泡释放和补充动力学保持完整。通过免疫染色验证，胶质单培养中不包含残留的小鼠神经元，确认记录的突触电流确实源自iN突触。这些结果证明在冷冻电镜载网上培养人iNs不会干扰突触传递或短时程突触可塑性的基本特性。
为进一步研究EM载网上生长iNs的电学特性，研究人员进行了电流钳电生理记录。当使用双极电极以30 mA电流进行细胞外场刺激时，ON-grid iNs产生的动作电位（action potentials，APs）数量显著少于OFF-grid iNs。然而，通过膜片钳直接电流注入揭示ON-grid和OFF-grid iNs产生相似数量的APs。静息膜电位、电容、基强度（rheobase）和AP半宽等内在电学特性在两种条件之间具有可比性。这些发现支持EM载网充当细胞外电刺激的电流汇，减少了到达轴突的细胞外电流，而非改变神经元内在兴奋性。
在电生理分析之后，将载网上生长的人iN培养物玻璃化并进行cryo-ET成像。三维断层图揭示了保存良好的神经元超微结构，包括含有丰富突触囊泡的突触前末梢，以及线粒体、内质网（endoplasmic reticulum，ER）和微管等细胞内细胞器和细胞骨架元件。ER-线粒体接触位点和ER-微管相互作用也在三维断层图中清晰可见。在突触接触位点，囊泡在推定活性区附近的突触前膜处聚集，pre-和postsynaptic区室被清晰界定的突触间隙分离。突触间隙平均宽度为27.57 ± 2.67 nm。突触后膜上可见蛋白密度，但相对于大鼠海马神经元，人iN突触的突触后致密区（postsynaptic density，PSD）对比度显著较低，这与Ngn2衍生人类突触的蛋白质组学分析一致，表明人iNs中突触前蛋白相对于突触后组分优先富集。在一些突触中，检测到与内吞或外排事件一致的囊泡中间体，位于突触前膜和突触后膜附近。推定的内吞事件恰好发生在PSD边缘，与先前关于突触后内吞区的报道一致。突触囊泡直径的定量测量显示尺寸分布为49.2 ± 6.3 nm（n = 485个囊泡，来自3个独立载网的3张断层图中的5个突触），略大于先前报道的啮齿动物突触囊泡直径。
**三、关键技术方法**
研究人员建立了一套集成平台，关键技术方法包括：（1）人iN分化培养体系：使用多西环素诱导的Ngn2表达实现H1人胚胎干细胞（WiCell，WA01，第42代）向兴奋性神经元的高效分化，经嘌呤霉素筛选获得纯化神经元群体；（2）载网神经元培养与玻璃化：将Quantifoil R2/2金质EM载网（200目）经辉光放电和多聚赖氨酸处理后置于小鼠胶质饲养层上方，人iNs在载网上培养至DIV40后进行电生理验证，随后使用Vitrobot Mark III在100%湿度、22°C条件下进行 plunge-freezing 玻璃化；（3）全细胞膜片钳电生理记录：对ON-grid和OFF-grid iNs进行电压钳和电流钳记录，评估自发/诱发性突触传递、短时程可塑性及内在膜特性；（4）冷冻电镜断层扫描成像与三维重建：在300 kV Titan Krios G4i（配备K3探测器，像素尺寸3.3 ?，倾转范围±52°，步距2°）或Glacios（配备Falcon4探测器，像素尺寸2.47 ?或3.11 ?，倾转范围±48°，步距3°）上采集倾转序列，使用AreTomo2进行对齐和重建；（5）图像分割与定量分析：使用MemBrain-Seg和Amira进行膜分割和三维可视化，CryoVesNet用于突触囊泡直径的自动测量。
**四、研究结果**
**1. 人iNs可在冷冻电镜载网上培养并维持**
研究人员通过将原代神经元EM载网培养策略与优化的人iN分化和维持方案相结合，建立了载网培养方案。将EM载网直接置于汇合胶质单层上方再进行神经元接种的策略，同时降低了载网表面的细胞密度，增加了玻璃化后可视化突触的概率，同时保持了来自胶质饲养层的功能支持。将神经祖细胞接种密度从每孔约70,000个iNs提高至约80,000个iNs。在DIV40时，载网上和载网外人iNs形成了跨越多个载网方格的致密互联网络，并形成对AMPA受体抑制剂CNQX敏感的功能性谷氨酸能突触。
**2. 载网上培养的人iNs具有功能完整性**
全细胞膜片钳记录显示，ON-grid和OFF-grid iNs的sEPSC频率、幅度和动力学无显著差异，表明自发神经递质释放和突触后受体表达在载网生长神经元中得以保留。ON-grid神经元的eEPSC幅度较小，但配对脉冲比率和重复刺激下的短时程突触抑制在两种条件下相当，表明突触前释放概率和囊泡释放-补充动力学未受载网培养影响。胶质单培养免疫染色排除了残留小鼠神经元的贡献，确认记录信号源自iN突触。
**3. 冷冻电镜载网充当电流汇**
电流钳记录表明，双极电极细胞外刺激时ON-grid iNs产生更少的动作电位，而直接电流注入时两种条件下AP产生数量相当。基强度、电容、静息膜电位和AP半宽等内在特性无差异。这些结果证明EM载网充当了细胞外电刺激的电流汇，而非改变神经元内在兴奋性。
**4. 冷冻电镜断层扫描揭示人iN突触的结构特征**
三维断层图揭示了保存良好的突触超微结构，包括含有丰富突触囊泡的突触前末梢、线粒体、内质网和微管。突触前和突触后区室被清晰界定的突触间隙（平均宽度27.57 ± 2.67 nm）分离。突触后膜上可见蛋白密度，但PSD对比度显著低于大鼠海马神经元。在突触前膜和突触后膜附近检测到推定内吞/外排事件的囊泡中间体。突触囊泡直径分布为49.2 ± 6.3 nm，略大于啮齿动物报道值。
**五、讨论与结论**
该研究建立了将人iN在冷冻电镜载网上的培养与功能性电生理验证和cryo-ET相结合的平台，证明人iNs在EM载网上生长时保持正常的突触传递和短时程可塑性，并兼容高分辨率cryo-ET结构分析。该工作补充了通过cryo-ET可视化人iNs突触的稀缺结构和功能数据集，使人类突触组织的直接研究成为可能，弥合了人类神经系统功能与超微结构研究之间的关键鸿沟。该方案易于适用于患者来源的神经元、遗传扰动和药理学操作，为跨多种实验范式研究人类突触结构和功能提供了强大框架。
关于人iN突触中观察到的较大突触囊泡尺寸，研究人员指出其可能与Ngn2衍生人类神经元和原代大鼠海马神经元之间已报道的功能差异有关。先前的研究发现这些细胞表现出与分离的大鼠海马神经元相当的mEPSC频率，但具有更大的mEPSC幅度。较大的突触前囊泡可能容纳更多的谷氨酸，从而贡献于增加的量子大小和更大的mEPSC幅度。较大的囊泡直径可能是iNs中囊泡膜独特脂质组成的结果。然而，囊泡大小不太可能是mEPSC幅度的唯一决定因素，突触后受体数量、组成、定位和突触间隙几何形状也可能有所贡献。此外，iN突触中缺乏稳健的PSD可能是沉默或不成熟突触形成的结果。研究中仅从158个倾转序列中鉴定出5个突触，当前分析样本量有限。Ngn2诱导的神经元形成的突触主要为谷氨酸能，未来工作需将该方法扩展到抑制性突触、混合人类神经元亚型群体和更成熟的网络状态。使用人星形胶质细胞替代小鼠星形胶质细胞将创造更均一的培养体系，避免种属间相互作用的潜在假象。与冷冻相关光学和电子显微镜（cryo-CLEM）的整合可能进一步增强突触靶向，揭示多种神经系统疾病的关键超微结构基础。
综上所述，研究人员建立了一个集成的结构-功能平台，成功将人iNs培养于EM载网，通过电生理记录验证了载网上突触的功能完整性，并利用cryo-ET实现了功能性验证的人类突触的超微结构可视化。研究结果表明EM载网对细胞外电刺激具有电流汇效应，但不影响突触传递的内在特性。通过cryo-ET观察到的突触囊泡池、活性区近端囊泡、突触后致密区和相关细胞器为人类iNs突触组织提供了初步的纳米级结构见解。该工作为结构和功能联合解析人类iNs之间的突触组织奠定了基础，并为干细胞衍生人类神经元突触的cryo-ET成像提供了重要方法学参考。
