通过微生物表面展示技术提升新型纤维素-木聚糖复合酶在木质纤维素原料上的糖化性能

《Bioresource Technology》：Enhancement of novel cello-xylosome saccharification performance via microbial surface display on lignocellulosic feedstocks

　　• 一种新型人工纤维素-木聚糖体展示在大肠杆菌（*Escherichia coli*）细胞表面。• 工程化细胞主要从底物中释放单糖和双糖。• 全细胞对植物原料表现出合理的可重复使用性。## 引言作为地球上最丰富的可再生有机碳源，木质纤维素生物质包括农业废弃物和市政有机废物。全球陆地生物质估计约为1.8万亿吨，年植物废弃物可达1400亿吨（Hsin et al., 2025）。然而，由于木质纤维素对酶解的内在抗性，大规模将其转化为生物化学品在经济上仍面临挑战（Schmitz et al., 2022）。纤维素和半纤维素是非淀粉多糖（NSPs），构成了陆地生物质的主要碳水化合物部分，也是一种尚未被充分利用的可发酵糖储备库。然而，这些非淀粉多糖在转化为高附加值产品之前，必须先被降解为寡糖和单糖。微生物碳水化合物活性酶（CAZymes）是这一生物转化的核心，它们被系统分类为糖苷水解酶、多糖解聚酶、碳水化合物酯酶和辅助活性酶。自然界中已演化出三种主要的微生物策略来克服植物细胞壁类似非淀粉多糖的抗性。第一种是兼性细菌和真菌分泌游离酶，例如里氏木霉（*Trichoderma reesei*）和黑曲霉（*Aspergillus niger*）（Glass et al., 2013, Payne et al., 2015）。第二种是纤维素体（cellulosome），一种在厌氧细菌如嗜热梭菌（*Clostridium thermocellum*）中发现的多酶复合体。其支架蛋白主要通过黏合素（Coh）-对接素（Doc）相互作用，将协同酶（内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）与碳水化合物结合模块（CBMs）组织在一起，从而实现底物锚定并提高催化效率（Artzi et al., 2017, Lamote et al., 2023）。第三种是多糖利用位点（PUL），这是拟杆菌门（如拟杆菌属*θ*亚种*_thetaiotaomicron*）特有的基因簇，编码表面糖结合蛋白、TonB依赖性转运蛋白和定制CAZymes，用于识别、结合、降解和转运特定的寡糖（Alvarez et al., 2025）。值得注意的是，一些功能未知结构域（DUFs）通常是PUL特有的，被认为作为碳水化合物利用的膜结合间隔物起作用（Hameleers et al., 2024）。鉴于其出色的降解植物生物质能力，模拟细菌纤维素体的结构和功能已成为生物质利用的一个极具吸引力的策略。大量努力已致力于通过整合定制酶面板和理性优化的连接序列来构建大规模合成纤维素体，以大肠杆菌或酵母作为支架平台，实现多糖的底物特异性降解。例如，科学家构建并将迄今为止最大的设计纤维素体锚定到马克斯克卢维耶酵母（*Kluyveromyces marxianus*）细胞表面，该体系被有效用于将磷酸膨胀纤维素生物转化为乙醇（Khatoon et al., 2025）。过去几十年来，利用多样化的Coh-Doc配对来组装大量设计纤维素体已有广泛报道（Bule et al., 2018）。最初，这些相互作用被认为是种特异性的。然而，后续研究表明，不同物种之间普遍存在双重或多重结合的Coh-Doc交叉作用，特别是在II型系统中，突出了Coh-Doc相互作用在纤维素体构建中显著广泛的跨物种适应性（Bule et al., 2018, Song et al., 2025）。此外，人工纤维素体上酶复合体的紧凑组织可能导致空间位阻，从而可能降低催化性能。来自*C. thermocellum*的支架蛋白CipA的构象动力学研究表明，Coh-Coh接触可能在纤维素体形成过程中对多种酶的精确空间排列起关键作用（Barth et al., 2018）。此外，这些超分子组装的结构复杂性使其构建在技术上具有挑战性。例如，大多数Coh-Doc相互作用严格依赖于钙离子，通常需要存在毫摩尔浓度的Ca2?才能实现有效的复合体形成（Vanderstraeten et al., 2022, Elias et al., 2025）。因此，鉴定具有多种催化功能的新CAZymes为开发简化但高性能的纤维素体提供了一条有吸引力的途径，通过减少对设计复合体中众多单个酶和Coh-Doc连接的依赖，从而构建更简化的体系。本研究设计并将一种新型纤维素-木聚糖体锚定在大肠杆菌细胞表面，其中整合了此前从绵羊瘤胃微生物组中获得的两高活性CAZymes，即葡聚糖酶IDSGLUC5-28和木聚糖酶IDSXYN10-1。通过酶消化和荧光分析验证了所设计纤维素-纤维素体的组装。随后，评估了工程化细胞在多糖和植物来源原料糖化方面的性能。## 章节片段### 材料与化学品菌株大肠杆菌BL21 (DE3)和大肠杆菌BL21:Δ*CsgA*，以及质粒pET28a(+)/*IDSGLUC5-28*（原Cel5A-h28）和pET30a(+)/*XYN-LXY*此前已保存（Wang et al., 2015, Gao et al., 2025）。所用多糖包括大麦β-葡聚糖（BG）、冰岛苔藓地衣聚糖（IML）、罗望子种子木葡聚糖（TSG）、魔芋葡甘聚糖（KGM）、象牙果甘露聚糖（INM）、山毛榉木木聚糖（BX）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、纤维素寡糖（COS）[纤维素二糖（G2）、纤维素三糖（G3）、纤维素四糖（G4），### IDSGLUC5-28和IDSXYN10-1的序列分析*IDSGLUC5-28*（GenBank: MN537812）和*IDSXYN10-1*（GenBank: KP723541）的开放阅读框分别为1,443和1,923 bp，分别编码480和640个氨基酸。系统发育分析表明，IDSGLUC5-28与来自地衣芽孢杆菌的葡聚糖酶BlCel5B、来自降解糖异养菌的SdGluc5_26A以及来自热纤毛菌属的F32EG5聚为GH5家族（图1）。类似地，IDSXYN10-1与来自灰绿青霉的木聚糖酶XylE和来自热泉菌的Xyn10B聚为一类### 结论本研究在大肠杆菌BL21:Δ*CsgA*细胞表面组装了一种由葡聚糖酶IDSGLUC5-28和木聚糖酶IDSXYN10-1组成的新型纤维素-木聚糖体。单独使用IDSGLUC5-28或IDSXYN10-1即可从葡聚糖和木聚糖类似底物中产生单糖和双糖。BL21:Δ*CsgA*/纤维素-木聚糖体被证明能更有效地催化多糖和天然木质纤维素材料的降解，产生的总还原糖与游离酶相当。### CRediT作者贡献声明**徐子涵：** 调查。**李诺：** 撰写——初稿，软件，调查。**徐晓峰：** 调查。**陆佳慧：** 调查。**高德盈：** 调查。**张铁涛：** 资源。**文正顺：** 资金支持。**王家坤：** 监督，资金支持。**王谦：** 撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金支持，概念构思。### 未引用参考文献Zhang et al. (2006).### 利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本论文所报告的工作。### 致谢本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFD1300704）、国家自然科学基金（32372917）、浙江省海洋产业科技项目（2026HYB01004）和温岭梅花鹿育肥关键技术研发与示范项目（20230402033GH）的支持。感谢浙江大学动物科学学院实验教学中心曾卫东先生提供的设施支持。---徐子涵|李诺|徐晓峰|陆佳慧|高德盈|张铁涛|文正顺|王家坤|王谦