结合分子印迹技术的分级3D打印电化学表面增强拉曼光谱（EC-SERS）平台用于左乙拉西坦监测

《Biosensors and Bioelectronics》：Hierarchical 3D-printed electrochemical surface-enhanced Raman spectroscopy (EC-SERS) platform integrated with molecular imprinting for levetiracetam monitoring

　　

• 集成的电化学-拉曼增强光谱（EC-SERS）/分子印迹聚合物（MIP）平台实现了选择性左乙拉西坦监测。
• 可重构3D打印电极实现了EC-SERS传感的可扩展化。
• 激光激活和金纳米花（AuNFs）生成了改善的等离子体热点。
• 电化学调制增强了分析物富集和拉曼信号放大。

**引言**

癫痫是一种影响全球超过5000万人的重大健康问题，是神经内科最常见的疾病之一。癫痫的特征是反复发作的无诱因性癫痫发作，源于神经元异常放电。癫痫常常伴随显著的心理、认知和社会经济影响，从而影响整体生活质量。尽管临床实践中已有许多抗癫痫药物可用，但由于药物代谢的个体差异、合并症和不良反应风险，治疗优化仍然具有挑战性。左乙拉西坦（LEV，C?H??N?O?）被广泛认为是一种有效的抗癫痫药物，这得益于其有利的药代动力学特性、最小的药物相互作用以及在各类患者群体中的广泛适用性。尽管如此，左乙拉西坦的治疗药物监测对于确保适当剂量、减少毒性和防止治疗失败至关重要。临床实践要求对包括左乙拉西坦在内的抗癫痫药物进行快速、选择性和高灵敏度的监测，这凸显了需要改进传统实验室技术的分析方法的必要性。尽管左乙拉西坦在抗癫痫药物中表现出有利的药代动力学特性，但肾清除率的临床显著变异、年龄依赖性代谢、合并症和患者依从性可能导致循环药物浓度波动。左乙拉西坦在血清中常见的治疗参考范围约为12-46 μg/mL，而低于或高于此范围的血药浓度可能降低疗效或引发不良神经和精神症状，包括嗜睡、头晕、烦躁和行为障碍。此外，左乙拉西坦相对较短的消除半衰期（在成人中约6-8小时）以及其对肾功能的依赖性可能需要反复调整剂量和纵向监测，特别是在儿科、老年、危重或肾功能不全患者中。这些局限性凸显了快速发展快速、灵敏、去中心化的即时检测（POC）分析平台的迫切需求，以支持实时治疗药物监测和个性化癫痫管理。

高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）以及毛细管电泳仍然是检测患者样本中左乙拉西坦的金标准传统分析方法。然而，由于这些方法依赖精密仪器、复杂的样品前处理、较长的分析时间和高昂的成本，不太适用于即时检测或去中心化监测。成本效益高的光谱技术，特别是拉曼光谱，以及电化学传感作为替代方法正受到越来越多的关注；然而，每种方法都有其固有的局限性。单独的电化学缺乏固有的分子指纹识别能力，而SERS则提供了具有极高灵敏度的化学特异性振动信息。然而，电化学与SERS的整合除了信号增强之外还提供额外优势，包括对分析物吸附的电化学控制、分子取向、界面电荷分布以及电极表面的局部富集，从而改善了光谱重现性、选择性和实时界面监测能力。将这些技术整合到互补的EC-SERS平台中代表了重大进展，将定量的电化学精确性与分子特异性结合在单一分析系统中。EC-SERS的性能很大程度上取决于能够同时作为高效电化学界面和等离子体活性底物的电极架构。3D打印电极作为新兴的电化学平台类别，通过实现低成本制造、定制化和EC-SERS平台的快速原型开发，提供了显著优势。导电碳黑-聚乳酸（CB-PLA）耗材实现了3D打印电极系统的可扩展制造，具有可调的架构和尺寸，为即时检测提供了独特优势。尽管有这些优势，裸3D打印电极由于导电区域被聚合物包裹，电化学性能通常受到限制，因此需要后制造修饰。激光烧蚀提供了一种关键的修饰方法，通过增加表面粗糙度、暴露导电碳点和显著增强电子转移动力学来激活表面。这种激活的表面为后续修饰和纳米材料整合提供了理想的基底。金纳米结构的电沉积进一步将电极转变为混合电化学-光学换能器，从而增强了EC-SERS平台中的灵敏度。除了SERS活性外，金纳米结构表现出对巯基化表面修饰剂的高度亲和力，从而实现稳定的功能化和长期的操作稳健性。本研究合成的金纳米结构以分形金纳米花（AuNFs）形式制造，呈现出具有密集纳米尺度突起的层级形貌。这种架构促进了等离子体热点的形成，显著增强了局部电磁场，从而放大了拉曼散射信号。在缺乏针对左乙拉西坦的已建立天然识别元件（如适配体或抗体）的情况下，分子印迹聚合物提供了一种可靠的替代方案，提供合成、稳定且成本效益高的识别位点，具有高选择性和在多样化实验条件下的韧性。

尽管分子印迹、SERS活性纳米结构和电化学传感已被单独用于化学分析探索，但将它们整合到可扩展的、结构可重构的EC-SERS平台中仍然有限。特别是，大多数先前报道的系统依赖于静态SERS基底、不可再生的电极架构或表面可编程性有限、电化学可调性受限的传统制造方法。本研究通过以下协同整合解决了这些局限性：增材制造的可重构电极、激光诱导的表面激活、层级AuNFs等离子体工程、电化学诱导富集以及基于MIP的分子识别，整合在统一的传感平台中。本研究的关键创新在于开发了新的电极架构，而非独立使用这些现有技术。在先前的研究中，3D打印主要用于制造独立的工作电极，这些电极配合外部参比电极和对电极使用；据我们所知，本研究首次描述了混合SPCE设计，其中原生SPE工作电极区域被单独制造的3D打印CB-PLA工作电极替代，同时保留了集成的参比电极和对电极，也是首次将此配置应用于EC-SERS分析。该架构将传统的可丢弃SPCE转变为可重复使用、可再生和结构可重构的传感平台，可以反复清洗、激光激活，并随后用等离子体纳米结构和生物识别元件进行功能化。重要的是，优化后的3D打印电极表现出与商业SPCE相当甚至在某些关键指标上超过其性能的电化学性能，证明了增材制造可以在不牺牲分析能力的情况下制造高性能电极。与被动SERS系统不同，所开发的架构能够实现EC-SERS响应和拉曼增强的动态电化学调制，同时保持可扩展制造、可再生电极功能和与标准化商业SPCE配置的兼容性（图1）。该方法在标准化商业平台与可定制的下一代电极设计之间建立了实用的桥梁。可重构工作电极支持层级后制造修饰，包括激光激活和AuNFs电沉积，生成优化用于EC-SERS增强的等离子体活性界面。分子特异性通过以吡咯为功能单体、以左乙拉西坦为模板合成的合理设计MIP引入。模板去除产生定义明确的识别空腔，能够在复杂基质中高亲和力、选择性地捕获目标物。如图1所示，优化电位下的电化学调制协同放大拉曼响应，实现超灵敏、选择性和可重复的左乙拉西坦检测。通过将增材制造、层级纳米结构、电化学调节和合成分子识别整合在单一平台中，本研究建立了用于便携式、高性能治疗药物监测的通用框架，并为可扩展的下一代EC-SERS诊断奠定了基础。

**3D打印SPCE的制备**

工作电极通过熔融沉积成型（FDM）工艺制成圆柱形几何结构（直径4 mm，厚度2 mm），所得结构的平均质量约为30 mg。3D打印参数详见表S1。在互补程序中，使用UV激光微加工选择性去除商业SPCE的工作电极区域，切割直径定义为4 mm。激光参数优化在25 kHz频率、22 μm束径条件下进行。

**3D打印SPCE/激光和3D打印SPCE/激光/AuNFs的形态表征**

扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）分析为含氧碳域和AuNFs在3D打印SPCE表面成功制备提供了全面证据。在低倍（×55）（图2a）下，CO?激光处理产生了定义明确的平行凹槽，间距约为300 μm，增加了表面粗糙度并暴露了嵌入PLA基质中的导电碳黑域。这些凹槽不仅……

**结论**

在本研究中，我们开发了一种结构集成的EC-SERS平台，通过增材制造、激光表面工程、层级等离子体纳米结构、电化学调制和分子印迹的协同组合，实现了对左乙拉西坦的灵敏和选择性检测。与受限于结构可调性有限、与激进表面修饰兼容性差和可重复使用性受限的传统商业SPCE不同，3D打印……

**利益冲突声明**

作者声明不存在已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

**作者贡献声明**

Richard Horner：方法论。Justin P. McMurray：方法论、调查研究。Ngoc Nhu Vu：撰写——审阅与编辑、方法论、调查研究、数据整理。Majed Althumayri：撰写——审阅与编辑、方法论。Masoud Negahdary：撰写——初稿、验证、方法论、调查研究、数据整理、概念化。Gerard L. Coté：撰写——审阅与编辑、资源、资金获取。Samuel Mabbott：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督。

**利益冲突声明**

? 作者声明不存在已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

**致谢**

本研究由美国国家科学基金会"面向弱势人群精密先进技术与健康系统"工程研究中心（PATHS-UP，#1648451）资助。作者感谢本研究的SEM/EDS表征部分在德州农工大学材料表征核心设施（RRID: SCR-022202）完成。作者进一步感谢使用LPKF U4激光系统，该系统由美国海军研究办公室支持。

Masoud Negahdary | Ngoc Nhu Vu | Majed Althumayri | Richard Horner | Justin P. McMurray | Hatice Ceylan Koydemir | Gerard L. Coté | Samuel Mabbott