金属有机框架封装量子点/磁性石墨烯复合荧光编码熵驱动适配体传感平台用于致病性弧菌多重超灵敏检测

《Biosensors and Bioelectronics》：MOF-encapsulated quantum dots/magnetic graphene composite fluorescence-encoded entropy-driven aptasensing platform for multiplex ultra-sensitive detection of pathogenic Vibrio

　　

摘要

快速准确地鉴定复杂水产品基质中的致病性弧菌（Vibrio）对于食品安全至关重要。在此，提出了一种基于封装在金属有机框架（MOF）中的三重荧光编码量子点（QDs）探针和中温梭菌 Argonaute（CbAgo）的熵驱动检测平台（SEFAM），实现了水产品中弧菌的多重无 DNA 提取检测。SEFAM 平台利用可编程磁性适配体开关实现靶向细菌识别，从而启动熵驱动电路（EDC）响应并释放大量向导 DNA（gDNA），以刺激 CbAgo 的特异性切割活性。具有不同发射波段（430 nm、525 nm 和 635 nm）的多色量子点@MOF-5 用单链 DNA（ssDNA）修饰并与磁性氧化石墨烯（mGO）偶联，作为三重荧光探针用于区分三种弧菌。该平台对副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的检出限（LOD）分别为 6.8、4.3 和 6.2 CFU/mL，线性范围为 10¹-10⁸ CFU/mL。此外，通过 44 个真实样品的验证成功证明了 SEFAM 平台的实际应用性。本研究展示了一种高特异性、稳定性和可重复性的生物传感器，为复杂基质中致病性弧菌的现场多重检测提供了一种有前景的方法。

引言

水产品是全球食品供应链的重要组成部分，其质量与安全性对人类健康至关重要。然而，由于富含蛋白质且结缔组织松散（Wu et al. 2019），水产品易在加工和运输过程中受到食源性病原体污染。作为水产品中的主要食源性病原体，弧菌（Vibrio）属可通过未煮透的食物或伤口引起人类感染（Cui et al. 2024）。此外，即使是低剂量感染也可能引发多种症状，包括败血症、肠胃炎、创伤感染，严重时危及生命（Lv et al. 2024a）。副溶血性弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌等高致病性菌株的全球合并流行率为 39.62%（Ma et al. 2023）。然而，用于检测弧菌的培养法计数和聚合酶链反应（PCR）属于劳动密集型工作，需要耗时的前处理、严格的受控实验环境和受过良好培训的操作人员（Yilmaz and Goluch 2021; Fan et al. 2026）。此外，目标弧菌的低浓度和复杂的背景基质导致假阳性信号（Park et al. 2024; Ling et al. 2026），进一步限制了致病弧菌的准确检测和有效预防。

基于表位识别元件（如抗体、适配体和噬菌体展示肽）的生物传感系统通过直接靶向细菌表面抗原（如脂多糖和鞭毛蛋白）诱导构象变化从而触发信号转导，显著简化了前处理过程（Sarkar et al. 2023）。其中，适配体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选的单链 DNA/RNA 寡核苷酸（Su et al. 2022），结合了基因识别的序列可编程性（互补链自由设计）与表位识别的优势，从而实现灵活的信号输出模式。基于此特性，包含识别区域的适配体序列可通过茎 - 环结构和 G-四链体等构象切换功能与核酸酶催化反应（内切核酸酶/外切核酸酶/DNA 酶）协同作用（Ge et al. 2023），将目标结合事件转化为多样化的输出信号。作为与 CRISPR-Cas 系统同源的核酸内切酶，Argonaute（Ago）蛋白由稳定的 gDNA 引导，通过向导序列的第 10 至 11 位位置的小向导核苷酸形成碱基对，实现对目标序列的特异性切割（Wang et al. 2022），从而促进具有适配体可编程性的多目标检测。中温 CbAgo 在 37°C 下的高切割活性与其适配体反应构象的稳定性相容（Lu et al. 2024b），为构建基于可编程适配体的多重检测系统奠定了酶学基础。基于核酸分子工程的级联扩增网络，如滚环扩增（RCA）（Zhao et al. 2024）、指数恒温扩增（EXPAR）（Kang et al. 2025）和环介导等温扩增（LAMP）（Aubret et al. 2022），可高效扩增识别过程中释放的特异性序列。EDC 作为由整个系统固有熵增驱动且无需酶参与的线性单链 DNA（ssDNA）扩增电路，通过与由三条 ssDNA 链组成的预杂交复合物反应释放输入的特异性寡核苷酸（Zhang et al. 2007）。因此，EDC 特别适合作为前端适配体识别和后端 Ago 样核酸内切酶信号转导的有效信号放大工具。

近年来，纳米技术的快速发展为克服分子诊断在信号稳定性和基质干扰方面的固有局限性提供了可靠的解决方案。由于量子点（QDs）具有可调波长、窄半峰宽、良好的水溶性和抗漂白性能，是构建多重分子探针荧光标记的理想材料（Lv et al. 2024b; Wang et al. 2026）。QDs 的宽激发光谱和可调发射光谱使得单一激发激光能够同时激发不同颜色的 QDs，这是实现一锅法多重标记的关键特征。将数百或数千个 QDs 封装到单个标记中提供了简单有效的信号放大方式（Li et al. 2020）。鉴于由金属节点和有机配体组成的 MOF 具有高孔隙率、高比表面积和丰富的功能位点，它们已成为封装 QDs 的优秀选择（Liang et al. 2023; Zhang et al. 2024），其组成金属离子进一步增强 QDs 的荧光（Jiang et al. 2022）。例如，封装在 MOF 中的铜纳米簇（Cu NCs）相比单一纳米材料可将荧光信号增强 35 倍（Han et al. 2018）。因此，开发一种新型多色 QDs 集成探针用于多重编码适配体传感系统中的精确信号转导，以实现复杂基质中细菌的快速、可靠和灵敏检测是理想的。

在此，我们构建了一种结合 Ago 编码 MOF 封装多色 QDs-ssDNA@mGO 纳米复合探针的固相 EDC 介导荧光适配体传感平台，用于同时检测水产品中的多种致病弧菌，称为 SEFAM 平台。SEFAM 平台集成了磁珠（MBs）的高效分离能力、无酶放大（EDC）的低环境敏感性和 CbAgo 蛋白的可编程性：磁性适配体开关在适配体 - 靶标识别后实现快速分离，具有节省时间并消除食品基质对后续反应干扰的特点；此外，集成的 EDC 反应可通过固相上适配体的互补单链触发有效产生大量能够激活 CbAgo 蛋白的 gDNA；具有不同发射波段的三种 MOF 封装 QDs-ssDNA@mGO 纳米复合探针中的互补 ssDNA 在相应 gDNA 的引导下被 CbAgo 特异性切割，从而实现了对副溶血性弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌的同时检测。

章节摘要

材料和设备

实验涉及的材料和设备细节见补充材料。

三种弧菌适配体磁性触发开关的合成

每种生物素化适配体（Aptamer-VP、Aptamer-VV、Aptamer-VC）及其等价摩尔量的互补链（cDNA-VP、cDNA-VV、cDNA-VC）溶解于 Tris-HCl 缓冲液中，在 95°C 下孵育 5 分钟以确保 DNA 结构适当解链，然后在室温下冷却 1 小时以确保正确配对和双链形成。制备的

SEFAM 平台多重检测致病弧菌的机制

SEFAM 平台多重检测致病弧菌的检测原理如图 1 所示。三种设计的靶标致病弧菌识别序列通过碱基互补与生物素标记的单链互补 DNA（cDNA）配对形成双链螺旋结构（图 1A）。随后，生物素标记的 dsDNA 分别组装到链霉亲和素修饰的 MBs 表面，形成具有特定

结论

总之，我们开发了一种磁性固相 EDC 驱动 CbAgo 偶联量子点编码适配体传感平台（SEFAM），它能够有效克服复杂基质中背景信号的干扰、低目标丰度下检测灵敏度的不足以及传统酶促扩增的环境敏感性限制，从而提高水产品中弧菌检测的灵敏度和准确性。磁性触发开关的设计

CRediT 作者贡献声明

Qiong Liu：撰写 – 审阅与编辑。YongQiang Ren：可视化。YingJian Zhang：监督，概念化。Shuang Chen：撰写 – 初稿，概念化。Huayang Wang：方法学，概念化。Guoyang Chen：方法学，数据整理。Huiling Li：撰写 – 审阅与编辑，经费获取。Xiaoqi Yi：可视化，数据整理。Jiaqi Zhao：数据整理。Haoyong Ning：数据整理。Feiyu Cai：方法学。Yaxuan Chen：数据整理。Jing Chen：方法学，

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32502349）；江苏省自然科学基金（BK20241095）；福建省自然科学基金（2024J08096，2025Y9719）的支持。

Shuang Chen|Qiong Liu|Xiaoqi Yi|Jiaqi Zhao|Huayang Wang|Guoyang Chen|Yaxuan Chen|Jing Chen|Haoyong Ning|Feiyu Cai|YongQiang Ren|YingJian Zhang|Xinran Xiang|Huiling Li