《Brain Stimulation》：Vagus Nerve Stimulation Exerts Disease-Modifying Effects in Epileptic Rats by Enhancing Hippocampal Adenosine Signalling
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迷走神经刺激（Vagus Nerve Stimulation, VNS）是难治性癫痫的有效治疗方法，但其长期疾病修饰作用的机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨VNS是否通过调节海马腺苷信号通路发挥抗癫痫及疾病修饰作用。研究人员建立了毛果芸香碱诱导的癫
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迷走神经刺激（Vagus Nerve Stimulation, VNS）是难治性癫痫的有效治疗方法，但其长期疾病修饰作用的机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨VNS是否通过调节海马腺苷信号通路发挥抗癫痫及疾病修饰作用。研究人员建立了毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠模型，采用光纤光度法（fiber photometry）结合基因编码的腺苷传感器GRABAdo1.0实时监测海马细胞外腺苷动态变化，通过视频脑电图（video-EEG）记录自发性反复发作（spontaneous recurrent seizures, SRS），利用Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）评估空间学习记忆能力，并通过免疫荧光和Western blot检测腺苷激酶（adenosine kinase, ADK）与腺苷A1受体（A1 receptor, A1R）的表达水平。研究结果表明：VNS可快速诱发癫痫大鼠海马腺苷释放；VNS显著减少SRS频率并缩短发作持续时间，同时改善空间记忆缺陷；上述抗癫痫及认知改善效应在停止刺激4周后仍持续存在；VNS抑制了癫痫相关星形胶质细胞ADK的过表达，并恢复了下调的神经元A1R表达；给予选择性A1R拮抗剂DPCPX可逆转VNS的抗癫痫效应。研究结论：VNS通过增强海马腺苷信号通路，特别是ADK–A1R通路，在癫痫大鼠中发挥持续的抗癫痫和认知改善作用，提示该通路是VNS疾病修饰效应的关键分子机制和潜在治疗靶点。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
癫痫是最常见的神经系统疾病之一，常伴随严重的并发症和共病。尽管抗癫痫药物广泛使用，仍有约30%的患者发展为药物难治性癫痫。手术切除致痫组织虽对部分药物难治性患者有效，但许多患者不适合手术，且部分患者术后发作控制仍不理想，因此亟需新的有效治疗策略。
迷走神经刺激（VNS）是难治性癫痫的成熟疗法，大量临床证据表明VNS可减少发作频率、改善认知功能和生活质量。约45%–65%的药物难治性癫痫患者在接受VNS治疗后发作频率减少超过50%。值得注意的是，VNS的疗效常随治疗时间延长而增加，提示其可能具有疾病修饰作用。然而，VNS长期疾病修饰效应的精确机制仍不完全清楚。
腺苷是公认的内源性抗惊厥物质，是癫痫发生和疾病修饰的关键调节因子。腺苷的抗惊厥效应主要通过激活腺苷A1受体（A1R）介导，而腺苷激酶（ADK）是腺苷代谢的主要酶，癫痫海马中ADK的过表达会降低细胞外腺苷可用性，促进癫痫发作的发生和进展。因此，腺苷–ADK–A1R信号通路可能构成重要的治疗靶点。
研究人员前期在194例接受VNS治疗的药物难治性癫痫患者中考察了ADK相关基因的9个单核苷酸多态性，发现3个ADK变异体（rs11001109、rs7899674和rs946185）与VNS治疗后的发作减少显著相关，为腺苷代谢参与VNS治疗效应提供了临床支持。基于此，本研究建立毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠模型，系统考察VNS对海马腺苷信号通路、癫痫发作活动和认知功能的影响。
二、研究设计与主要技术方法
本研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠（260–300 g），建立氯化锂-毛果芸香碱诱导的颞叶癫痫模型。研究包含三个独立动物队列，最终纳入78只大鼠。主要纵向队列由72只大鼠组成，分为8组：对照组（16只，各时间点8只）、Pilo 6W组（8只）、Pilo 10W组（8只）、VNS 4W组（8只）、VNS 8W组（8只）、VNS 4-4W组（8只，接受4周刺激后停刺激4周）、Sham 4W组（8只）和Sham 8W组（8只）。DPCPX实验和光纤光度实验分别在另外两个独立队列中进行（各3只）。
主要技术方法包括：视频脑电图（video-EEG）记录用于监测自发性反复发作（SRS）；Morris水迷宫（MWM）测试评估空间学习记忆；基因编码腺苷传感器GRABAdo1.0结合光纤光度法实时监测海马细胞外腺苷动态；免疫荧光和Western blot检测ADK与A1R表达；选择性A1R拮抗剂DPCPX药理学干预验证A1R信号的功能参与。
三、研究结果
3.1 VNS诱发癫痫大鼠海马腺苷释放
通过光纤光度法结合GRABAdo1.0传感器实时监测海马CA1区细胞外腺苷动态，研究发现与刺激关闭期相比，VNS在刺激开启期（30 s和60 s）显著增加海马细胞外腺苷水平（0.00 ± 0.63 vs. 1.40 ± 0.68，n = 3，p < 0.01）。将刺激时间从30 s延长至60 s虽延长了腺苷释放持续时间，但峰值信号幅度无显著差异。该结果表明VNS可快速诱发癫痫大鼠海马腺苷释放。
3.2 VNS减少癫痫大鼠自发性反复发作
视频EEG记录显示，在第6周时间点，接受4周VNS治疗的大鼠发作频率显著低于未治疗癫痫大鼠（VNS 4W vs. Pilo 6W：1.0 ± 0.19 vs. 2.5 ± 0.33次/天，p < 0.01），而Sham 4W组与Pilo 6W组无显著差异。在第10周时间点，连续8周VNS治疗显著降低发作频率（VNS 8W vs. Pilo 10W：1.38 ± 0.26 vs. 3.38 ± 0.50次/天，p < 0.01）。值得注意的是，VNS 4-4W组在停止刺激4周后仍表现出较Pilo 10W组更低的发作频率（1.75 ± 0.25 vs. 3.38 ± 0.50次/天，p < 0.05）。发作持续时间方面呈现相似模式：VNS 4W组平均发作持续时间显著短于Pilo 6W组（40.25 ± 1.44 s vs. 49.13 ± 1.72 s，p < 0.01），VNS 8W组和VNS 4-4W组也分别显著短于Pilo 10W组。DPCPX实验显示，接受VNS 4周后给予A1R拮抗剂DPCPX的大鼠发作频率（3.3 ± 0.33次/天）和发作持续时间（50.00 ± 2.08 s）均显著高于单独VNS 4W队列（1.0 ± 0.19次/天，40.25 ± 1.44 s），表明A1R信号参与VNS的抗癫痫效应。上述结果提示VNS不仅减少发作频率和缩短发作持续时间，其抗癫痫效应在停止刺激后至少持续4周。
3.3 VNS改善癫痫大鼠学习记忆缺陷
MWM测试结果显示，在第6周和第10周时间点，毛果芸香碱处理大鼠穿越原平台位置的次数和目标象限停留时间均显著低于对照组，而VNS 4W组和VNS 8W组分别显著优于对应的Pilo 6W组和Pilo 10W组。VNS 4-4W组在停止刺激4周后仍表现出优于Pilo 10W组的空间记忆表现。Sham组与对应Pilo组之间无显著差异。该结果表明VNS可改善癫痫相关的认知缺陷，且该改善效应在停止刺激后持续存在。
3.4 VNS抑制癫痫大鼠海马ADK过表达
免疫荧光结果显示，对照组海马CA1、CA3和DG区ADK免疫反应性较弱，而Pilo 6W和Pilo 10W组各海马亚区均出现显著ADK过表达，且ADK信号主要与GFAP阳性星形胶质细胞共定位。VNS 4W组在CA1、CA3和DG区的ADK表达均显著低于Pilo 6W组（p < 0.01、0.05和0.001），VNS 8W组各海马亚区ADK表达显著低于Pilo 10W组（p < 0.001）。VNS 4-4W组在停止刺激4周后ADK免疫反应性仍显著低于Pilo 10W组（p < 0.01）。Western blot结果与免疫荧光一致：VNS 4W和VNS 8W组ADK蛋白水平显著降低，VNS 4-4W组ADK表达仍低于Pilo 10W组（p < 0.001）。该结果表明VNS抑制癫痫相关的海马ADK过表达，且该效应在刺激停止后持续存在。
3.5 VNS恢复癫痫大鼠海马A1R表达
免疫荧光结果显示，对照组海马CA1、CA3和DG区A1R免疫反应性清晰可辨且主要定位于神经元，而Pilo 6W和Pilo 10W组A1R表达显著降低。VNS 4W组各海马亚区A1R表达显著高于Pilo 6W组（p < 0.05、0.05和0.001），VNS 8W组各海马亚区A1R表达显著高于Pilo 10W组（p < 0.05、0.01和0.001）。VNS 4-4W组在停止刺激4周后A1R表达仍显著高于Pilo 10W组（p < 0.05、0.05和0.01）。Western blot结果进一步证实VNS 4W和VNS 8W组A1R蛋白水平显著升高，VNS 4-4W组A1R表达仍显著高于Pilo 10W组（p < 0.001）。该结果表明VNS减轻癫痫诱导的海马A1R下调并恢复A1R介导的腺苷信号。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，VNS在癫痫发生过程中启动治疗可产生持续的癫痫和认知获益，其效应在停止刺激4周后仍持续存在，提示VNS可能通过调节癫痫网络和腺苷相关信号产生疾病修饰作用。VNS快速诱发海马腺苷释放的急性效应与ADK或A1R蛋白表达的慢性变化在时间尺度上不同，前者更符合活动依赖性细胞外腺苷积累机制，可能涉及去甲肾上腺素能通路激活星形胶质细胞并参与ATP–腺苷–A1R信号；后者则通过抑制ADK过表达提高基础腺苷张力并延长反复刺激产生的腺苷的细胞外可用性。A1R信号的恢复可能通过减少反复发作活动和海马炎症反应实现。DPCPX实验支持A1R信号在VNS抗癫痫效应中的功能参与，但该实验仅为初步证据。研究局限性包括仅纳入雄性大鼠、光纤光度法和DPCPX实验样本量较小（各3只）。
研究结论：VNS在癫痫发生过程中启动治疗可产生持续的癫痫和认知获益，在毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠中发挥疾病修饰作用。VNS诱发海马腺苷释放、减少SRS频率和持续时间、改善空间学习记忆、抑制病理性海马ADK过表达并减轻A1R下调。多项有益效应在停止刺激4周后仍持续存在，表明VNS可诱导癫痫网络和腺苷相关信号的持续调节。上述发现支持海马腺苷信号通路，特别是ADK–A1R通路，是VNS治疗效应的关键机制和癫痫疾病修饰的潜在靶点。
