抗干扰素-γ自身抗体定量测量的分析验证与常规实验室实施：基于IC50抑制性ELISA的标准化方法及内部质量控制框架

《iScience》：Quantitative measurement of anti-interferon-gamma autoantibodies for routine laboratory implementation

　　

抗干扰素-γ自身抗体（Anti-interferon-γ autoantibodies，AIGAs）是成人起病免疫缺陷综合征（Adult-onset immunodeficiency，AOID）的免疫学标志，该综合征主要影响东南亚成年人并导致严重的复发性机会性感染。目前的AIGA检测依赖于缺乏标准化的半定量方法，限制了其在临床监测和多中心比较中的应用。研究人员开发并分析验证了一种以半数最大抑制浓度（Half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）为报告指标的定量抑制性酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。该试验在lgG AIGA浓度为2.51–4.92（对应337–85,316 RU/mL）范围内表现出优异的线性。可定量范围可向下延伸至93 RU/mL（相对于内部质量控制[Internal quality-control，IQC]血浆混合样本）。所有AIGA阳性IQC水平的批间几何变异系数（Geometric coefficient of variation，GCV%）为23.5%–30.7%。Levey-Jennings监测证实，在8个月的临床服务期间，单批试剂的性能保持稳定。该定量IC₅₀试验以82.86%的灵敏度和89.29%的特异度区分活动性病例与非活动性病例，而半定量参考方法为72.86%的灵敏度和85.71%的特异度。该定量ELISA提供了可靠、精确的AIGA测量手段和实用的内部质量控制框架，支持将AIGA检测纳入常规临床实验室以辅助AOID管理。

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**抗干扰素-γ自身抗体定量检测方法的建立与验证：推动成人起病免疫缺陷综合征实验室监测的标准化**

**一、研究背景与问题**

成人起病免疫缺陷综合征（Adult-onset immunodeficiency，AOID）是一种以产生抗干扰素-γ自身抗体（Anti-interferon-γ autoantibodies，AIGAs）为核心免疫学特征的获得性免疫缺陷病。这些IgG型自身抗体可结合于干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）的功能关键表位，阻断巨噬细胞活化及胞内病原体清除，导致反复发作的严重播散性机会性感染。流行病学数据显示，AOID在东南亚及中国南方人群中高度集中：一项系统性综述报告810例AIGA阳性患者中798例（98.5%）为亚裔；另一项涵盖20年文献的分析中，502例患者有493例（98.2%）来自东南亚。自2004年首次报道以来，全球已诊断超过600例，非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacterium，NTM）是最常见病原体（55.69%），其次为马尔尼菲篮状菌（*Talaromyces marneffei*，26.98%）、沙门菌属（*Salmonella* spp.，12.43%）和水痘-带状疱疹病毒（9.57%）。

尽管对该综合征的认识日益深入，AIGA的实验室检测仍面临严峻挑战。现有方法包括间接ELISA、抑制性ELISA、流式细胞术功能试验和快速免疫层析试验，但均以研究级应用为主，缺乏标准化、可溯源性和跨实验室可比性。流式细胞术通常被视为有益的参考方法，但需要专业设备和人员；间接ELISA操作简便但易受非特异性结合的干扰，在环境抗原高背景反应人群中假阳性率较高；大多数抑制性ELISA仍停留在半定量水平，仅报告滴度而非绝对浓度，缺乏标准化操作规程。严格验证的定量方法的缺失，加之内部质量控制（Internal quality-control，IQC）材料的供应有限和质量管理实践的缺乏，共同制约了跨实验室可比性及患者纵向监测的开展。在此背景下，研究人员开展本研究，旨在开发并分析验证一种适用于临床实验室正式质量管理框架的标准化定量AIGA检测方法。

**二、研究概述与意义**

研究人员开发了一种以半数最大抑制浓度（Half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）为报告指标的定量抑制性ELISA，并对该方法的线性范围、定量限、批间精密度及与半定量参考方法的一致性等关键性能特征进行了系统评价。同时，研究人员建立了一套实用的内部质量控制框架以监测检测性能。该定量IC₅₀试验在337–85,316 RU/mL范围内表现出经验证的线性关系，经验证定量限（Limit of quantification，LOQ）为93 RU/mL；以82.86%的灵敏度和89.29%的特异度区分活动性与非活动性病例，优于半定量参考方法（灵敏度72.86%，特异度85.71%）。该研究填补了AIGA检测标准化领域的重要空白，为AOID患者临床管理中的抗体水平纵向监测提供了可靠工具，并为后续多中心外部队列验证奠定了基础。

**三、关键技术与方法**

研究采用的技术方法包括：（1）抑制性ELISA平台——将待测血浆与300 pg/mL重组人IFN-γ预孵育后，用商品化IFN-γ检测试剂盒（BD OptEIA^TM）测定剩余游离IFN-γ浓度；（2）以多供者混合血浆制备四级阳性参考材料（低、中、高、极高）和阴性参考材料，用于校准曲线构建和IQC——阳性参考材料每级由5例患者血浆混合而成（各等级患者临床状态及滴度范围明确），阴性参考材料来自4例健康供者；（3）采用四参数Logistic（Four-parameter logistic，4PL）S形模型拟合抑制曲线，计算IC₅₀值，以相对单位每毫升（Relative units per milliliter，RU/mL）报告结果；（4）Log₁₀转换后进行线性回归构建校准曲线，计算检出限（Limit of detection，LOD）和定量限，并通过稀释法实验验证LOQ（CV%≤20%为标准）；（5）建立Levey-Jennings（L-J）质控图并结合Westgard多规则进行长期监测；（6）研究共纳入98份剩余肝素化血浆样本（2023年1月至12月采集），其中活动性病例70例、非活动性病例28例，来自泰国孔敬大学Srinagarind医院单一三级转诊中心；（7）方法对比采用Bland-Altman分析和DeLong检验评价ROC曲线差异。

**四、主要研究结果**

**（1）抑制性ELISA中IFN-γ检测范围的优化及自制校准品适宜cut-off点的确定**

研究人员通过比较不同浓度范围（0–600、0–300、0–150 pg/mL）的重组IFN-γ标准曲线，发现0–300 pg/mL范围的决定系数（Coefficient of determination，R²）为0.9964，较0–600 pg/mL范围（R²=0.8620）显著改善，且与更窄的0–150 pg/mL范围（R²=0.9978）相比提供了更宽的检测范围，故选定0–300 pg/mL作为后续抑制试验的标准浓度范围。连续20天每日测定各IQC水平的R²，以均值减3倍标准差为cut-off标准，确定可接受的R²阈值为0.972，实验结果显示良好的重现性。制备的四级阳性参考材料和阴性参考材料（特征详见表1），在不同稀释度下经抑制性ELISA分析，50%抑制率被确定为区分各级阳性参考材料与阴性参考材料的最适cut-off点。

**（2）AIGA定量抑制性ELISA的校准及分析范围确定**

四级阳性混合血浆连续20天测定后，经Log₁₀转换构建的四点校准曲线R²=0.9873，线性范围为Log₁₀ AIGA浓度2.51–4.92（对应337–85,316 RU/mL）。计算LOD为0.3406（对应2.19 RU/mL），计算LOQ为1.0321（对应10.77 RU/mL）。经验证：未稀释低阳性样本Log₁₀浓度2.49（314 RU/mL，CV%=18.9%，GCV%=21.1%），1:3稀释样本为1.97（93 RU/mL，CV%=11.4%，GCV%=12.5%），1:10稀释样本CV%达58.6%超出预设≤20%标准。因此经验证LOQ设定为93 RU/mL（Log₁₀ 1.97）。由此定义两个嵌套范围：线性验证定量范围337–85,316 RU/mL和扩展可定量范围下限至93 RU/mL。

**（3）常规服务用内部质量控制样本的选择**

在未转换RU/mL标尺上，低至极高浓度水平的CV%分别为25.7%、24.0%、22.4%和22.0%。Log₁₀转换后GCV%分别为30.7%、26.4%、24.8%和23.5%。Log₁₀转换被用于后续L-J监测，因其可稳定方差、改善控制值分布的正态性，从而满足Westgard规则有效解释的前提。L-J图显示所有阳性对照数据在可接受控制限内，但低阳性对照第12个数据点低于?2 S.D.，触发Westgard随机误差预警信号（1_2s），但该孤立的低水平警告未升级为更严重的规则违反，不指示系统性漂移。

**（4）常规医院实验室检测性能IQC监测的实施**

日常诊断服务中以阴性参考材料为每日阴性IQC，以中阳性参考材料为每日阳性IQC（因其无需预处理即可直接用于常规检测），在1:100、1:300、1:900和1:2,700四个稀释度下连续20天双复孔检测。阴性IQC始终未显示IFN-γ抑制。1:900稀释度的阳性IQC平均抑制率80.7%，S.D. 6.83%，可接受控制范围67.0%–94.4%；1:2,700稀释度平均抑制率35.1%，S.D. 5.99%，控制范围23.0%–47.3%，两稀释度分别覆盖IC₅₀分析的上下界。8个月临床服务期间（2025年3月至12月），Log₁₀转换AIGA浓度均值3.37，S.D. 0.08，所有测量均在可接受控制限（3.21–3.53）内，未观察到失控事件、系统性偏移或显著趋势，支持试剂在自解冻起约12个月间（2024年12月至2025年12月，4°C保存）的稳定性。

**（5）定量IC₅₀ AIGA试验与参考抑制滴度法的相关性及性能比较**

98份剩余血浆样本同时采用两种方法检测，IC₅₀ AIGA水平与抑制性AIGA滴度呈正相关（相关系数0.702，p<0.0001）。Bland-Altman分析显示平均偏倚3.70%（95%一致性限：?37.36%–44.76%），表明两方法间无系统性差异。ROC分析显示，以抑制滴度≥5,000为cut-off时灵敏度72.86%、特异度85.71%；IC₅₀试验鉴别活动性感染的AUC为0.901（灵敏度82.86%，特异度89.29%），略优于半定量参考方法的AUC 0.893，但两条ROC曲线间差异无统计学意义（p=0.7864，DeLong检验）。

**五、讨论与结论**

本研究建立的标准化定量AIGA检测方法及经验证的内部质量控制方案，回应了AOID临床管理中日益迫切的实验室标准化需求。考虑到该综合征复发率超过56%，且仅40.5%的患者单纯抗生素治疗有效，抗体定量监测对治疗决策至关重要。研究以抑制性ELISA为基础，通过制备和实施自制IQC材料（因无商业化IQC产品）确保了检测的准确性和重现性。本研究的主要意义在于首次对AIGA定量抑制性ELISA进行系统分析验证，并提供了一套在无商业化质控品条件下可行的内部质控框架。方法的批间精密度（GCV% 23%–30%）符合生物检定的一般要求（GCV%<30%）。Log₁₀转换虽未在绝对值意义上明显降低整体变异，但通过稳定方差和改善正态性，为Westgard规则的正确应用奠定了基础。中阳性水平校准品用作日常IQC具有优势，因其处于最佳分析测量范围内，便于检测分析误差或偏移。

在方法对比方面，两方法间定量一致性较差（相关系数0.702），这归因于连续浓度指标与基于稀释终点的半定量方法之间的本质差异。半定量方法报告抑制率超过50%的最终稀释度，易受稀释误差和离散步骤限制的影响；而定量IC₅₀试验通过对全稀释系列拟合4PL曲线确定精确50%抑制点，产生连续浓度值，可实现滴度法无法提供的纵向抗体水平追踪和明确的定量分析范围。定量监测AIGA水平在评估利妥昔单抗、环磷酰胺和硼替佐米等免疫抑制治疗的临床试验中具有关键终点价值。一项近期8年观察性队列研究（65例）强调，大多数AOID患者需要超过2年的延长抗微生物治疗，进一步支持定量AIGA监测在指导治疗时长和疗效评估中的临床需求。

研究结论：该定量IC₅₀抑制性ELISA能提供一致的AIGA测量结果，在区分AIGA阳性和阴性样本方面表现出强大的鉴别能力，且在所有IQC水平上性能稳健。这些发现支持该方法适用于常规实验室使用，并为在缺乏商业化IQC材料条件下实施AIGA定量检测提供了实用框架。

**研究局限性**：患者队列来自泰国东北部单一三级转诊中心，cut-off值和IQC参考区间需在不同地域和种族背景的独立队列中验证；IQC材料4°C稳定性仅通过L-J表现间接支持，未进行直接的生物化学稳定性测试和反复冻融评估；试剂批次间重现性未评估（全程使用单一批次试剂）；采用“RU/mL”报告格式是因目前尚不存在经独立赋值校准的AIGA参考标准品。