基于Chelex-100树脂的成年斑马鱼组织基因组DNA快速经济提取方法

《PLOS One》：A rapid and cost-effective Chelex-100 resin-based method for genomic DNA extraction from adult zebrafish tissues

　　

斑马鱼（Danio rerio）是生物医学研究中广泛使用的脊椎动物模型，然而从成年斑马鱼组织中快速且经济地提取基因组DNA（gDNA）对于常规分子应用仍是一个实际挑战。为解决这一问题，研究人员系统优化并评估了一种基于Chelex-100/蛋白酶K的提取方案，应用于八种成年斑马鱼组织（肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肠道、脑和卵），并将其性能与商业试剂盒进行了比较。优化后的方案包括56 °C孵育15分钟和100 °C煮沸10分钟，每个样本约需25分钟。在所有测试组织中（每种组织3个生物学重复），Chelex-100方法每5 mg组织获得的gDNA浓度范围为177.2 ± 3.5 ng/μL至674.5 ± 22.1 ng/μL，普遍高于商业试剂盒所得浓度。然而，Chelex-100方法的纯度（A₂₆₀/A₂₈₀比值）始终低于试剂盒（1.36–1.83 vs. 1.84–2.02），表明存在蛋白质类杂质的共提取。尽管如此，Chelex提取的gDNA仍成功支持了目标片段的PCR扩增和Sanger测序，扩增子质量一致。在实时荧光定量PCR（qPCR）检测中，两种方法均产生扩增曲线，但Chelex-100方法获得的循环阈值（Ct）系统性偏高，表明纯度较低的模板灵敏度有所下降。至关重要的是，Chelex-100方法避免了危险有机溶剂的使用，无需柱纯化，估计试剂成本低于0.20美元/样本，而商业试剂盒约为2.00美元/样本。研究人员得出结论，该优化的Chelex-100/蛋白酶K方案为成年斑马鱼组织常规gDNA提取提供了一种快速、经济且操作简便的替代方法，特别适用于基于PCR的基因分型、测序和qPCR应用，但其较低的纯度需在高灵敏度定量检测中予以谨慎考虑。

斑马鱼（Danio rerio）因其繁殖力强、早期胚胎透明、胚胎发育迅速、饲养成本低以及与人类约70%的基因同源性和82%的人类疾病相关基因保守性，已成为生物医学研究中用途最广泛的模式生物之一。这些特性使斑马鱼特别适合用于人类疾病建模（包括心血管疾病、神经系统疾病和代谢功能障碍）、毒理学评估以及高通量药物筛选。因此，从斑马鱼组织中可靠地提取基因组DNA（gDNA）是基因分型、测序和基因功能研究的基本需求。然而，目前从成年斑马鱼组织获得gDNA的方法，如苯酚-氯仿提取法和商业试剂盒法，虽可获得高纯度DNA，但通常耗时、费力、成本高或需要使用危险试剂，限制了其在常规、快速和高通量应用中的适用性。这些局限性促使人们需要一种更简单、更经济的DNA提取方法，以可靠支持下游分子分析。Chelex-100是一种螯合树脂，可通过结合二价金属离子使核酸酶失活，在碱性和煮沸条件下破坏细胞并去除PCR抑制剂，从而帮助释放细胞内的DNA并保护DNA免受核酸酶介导的降解。基于Chelex的DNA提取已广泛应用于法医微量样本、微生物、昆虫、啮齿动物、海产品和植物等领域，因其操作简单、污染风险低和样本损失少而支持法医鉴定、测序、基因分型、病原检测等应用。然而，关于其在成年斑马鱼组织中的应用研究较少，尤其是在多种组织类型中获得足以直接进行PCR分析的合格DNA方面。为填补这一空白，研究人员开发了一种快速简便的基于Chelex-100/蛋白酶K的gDNA提取方案，适用于成年斑马鱼多种组织，无需有机溶剂或柱纯化即可可靠支持下游PCR检测。该方法最大限度减少了操作步骤并降低了时间和成本，为生物医学、环境科学、药理学、农业和渔业中斑马鱼的常规分子研究提供了一种实用的替代方案。

研究人员以约6月龄野生型AB斑马鱼为实验材料，将雌雄各一只的同一组织样本混合作为1个生物学重复，每种组织设置3个生物学重复，每份样本标准化为3–5 mg。首先以肌肉组织为对象，对56 °C孵育时间（5、15、30、60分钟）和100 °C煮沸时间（5、8、10分钟）进行优化，以DNA浓度和纯度（A₂₆₀/A₂₈₀比值）为指标确定最佳条件。随后将该优化方案应用于肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肠道、脑和卵等组织，并与商业试剂盒（OMEGA Bio-Tek组织DNA试剂盒）进行比较。提取产物分别通过常规PCR（β-actin、18S rRNA、TLR9基因）、Sanger测序（TLR9片段）和qPCR（β-actin、TLR9、ikbaA基因）进行质量评估。样本来源为山东益喜悦生物科技有限公司，动物实验经河南科技大学动物伦理委员会批准（批准号HAUST-025-F0306016），并遵循ARRIVE指南。

研究主要使用了三个关键技术环节。第一，Chelex-100/蛋白酶K一步裂解法：样本在5% Chelex-100树脂和蛋白酶K存在下，经56 °C孵育15分钟后100 °C煮沸10分钟，离心后取上清直接作为DNA模板使用。第二，商业试剂盒提取法：按照制造商说明进行裂解、柱结合、洗涤和洗脱，作为对照方法。第三，下游分子验证体系：包括常规PCR扩增、Sanger测序和qPCR三种方式，分别用于验证提取DNA的扩增可行性、序列准确性和定量检测灵敏度。全部实验均设置至少3个生物学重复，统计分析使用GraphPad Prism 10.1.2，组间比较采用单因素方差分析（Tukey检验）或双尾t检验。

优化实验结果显示，在56 °C孵育时间梯度中，15分钟和30分钟的DNA浓度最高（分别为186.6 ± 1.2和186.0 ± 8.8 ng/μL），且两者无显著差异（P = 0.99），但60分钟时浓度显著下降至最低值（149.7 ± 6.1 ng/μL）。在100 °C煮沸时间梯度中，10分钟煮沸获得最高DNA浓度（192.4 ± 3.7 ng/μL），且与5分钟和8分钟组均有显著差异。因此确定最佳条件为56 °C孵育15分钟加100 °C煮沸10分钟，全程约25分钟。

在多种组织的gDNA提取比较中，Chelex-100树脂方法在肌肉、心脏、肾脏、肠道、脑和卵中获得的DNA浓度均显著高于商业试剂盒（p < 0.01），仅肝脏和脾脏两者无显著差异。Chelex-100方法在8种组织中每5 mg组织获得的DNA浓度为177.2 ± 3.5至674.5 ± 22.1 ng/μL，而商业试剂盒为117.6 ± 3.4至421.6 ± 8.4 ng/μL。但Chelex-100方法的纯度（A₂₆₀/A₂₈₀比值1.36–1.83）始终低于商业试剂盒（1.84–2.02），提示存在蛋白质等杂质的共提取。在方法比较中，Chelex-100方法在操作时间（约25分钟对3小时以上）、避免有毒试剂和使用成本（低于0.20美元/样本对约2.00美元/样本）方面具有明显优势，但纯度较低是其主要不足。

在PCR与测序验证中，两种方法提取的gDNA均可成功扩增β-actin、18S rRNA和TLR9基因片段，2%琼脂糖凝胶电泳显示扩增条带模式一致。TLR9片段的Sanger测序结果显示，两种方法提取的DNA所得序列与NCBI参考序列（登录号NC_133183.1）高度一致，说明Chelex-100法提取的gDNA可直接用于PCR产物测序并产生准确序列数据。在qPCR评估中，两种方法均产生良好扩增曲线，但Chelex-100方法在全部组织、全部三个基因（β-actin、TLR9、ikbaA）中均获得系统偏高的Ct值，表明纯度较低的模板降低了定量检测的灵敏度。

讨论部分指出，Chelex-100悬浮液的碱性与热变性结合可促进细胞膜破裂和核酸释放，蛋白酶K的加入则有助于组织消化和染色质解凝，从而提高DNA释放效率并缩短时间。Chelex法提取的DNA浓度高于试剂盒的原因可能与操作过程中样本损失更少以及共存杂质更多有关。较低的纯度源于该方案省略了去除蛋白质等杂质的纯化步骤。尽管常规PCR和测序结果表明存在一定量杂质不影响目标片段扩增，但qPCR结果明确提示低纯度模板会影响定量检测灵敏度，特别是在接近检测限的样本中。因此，该优化方案适合常规PCR和基础分子检测应用，但在需要更高灵敏度的定量检测中应谨慎评估。讨论部分还提出，鉴于斑马鱼在感染病和免疫学研究中的广泛应用，该方法可能有助于在水产养殖和研究中快速筛查常见病原（如脑假尾孢菌Pseudoloma neurophilia或爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri），但不同组织和病原体的适用性需要进一步验证。

研究结论部分作者指出，本研究建立了基于Chelex-100树脂的成年斑马鱼多种组织gDNA提取方法，总处理时间约25分钟，获得的DNA浓度较高，但因省略去除杂质的纯化步骤而纯度较低。与商业试剂盒相比，该方法在靶基因片段常规PCR扩增、TLR9片段Sanger测序和qPCR方面表现相当，可支持常规PCR和基础分子实验需求。其额外优势包括成本低（<0.20美元/样本）、速度快（约25分钟）且无需危险试剂，而商业试剂盒约2.00美元/样本且需3小时以上。然而，由于纯度较低，qPCR检测中所有测试组织的Ct值均偏高，表明灵敏度有所下降，可能影响低丰度靶标或接近检测限样本的定量。总之，该Chelex-100/蛋白酶K方案为成年斑马鱼gDNA提取提供了一种快速、经济且实用的替代方法，尤其适用于常规PCR类应用，但在纯度和qPCR灵敏度方面的局限性应根据具体实验需求加以考虑和解决。