《iScience》：A plant DNMT3 induces non-CG methylation and affects gene expression in human cells
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**论文摘要专业翻译**
CG甲基化是真核生物中最主要的DNA甲基化形式，而脊椎动物中的非CG甲基化主要局限于神经元和胚胎干细胞中，并由DNMT3酶介导。相比之下，植物中的DNMT3同源物能在多种组织中催化广泛的非CG甲基化。为了探究植物DNMT3
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**论文摘要专业翻译**
CG甲基化是真核生物中最主要的DNA甲基化形式，而脊椎动物中的非CG甲基化主要局限于神经元和胚胎干细胞中，并由DNMT3酶介导。相比之下，植物中的DNMT3同源物能在多种组织中催化广泛的非CG甲基化。为了探究植物DNMT3能否在人细胞中建立非CG甲基化并影响转录，研究人员在通常缺乏非CG甲基化修饰的HEK293细胞中表达了小立碗藓（*Physcomitrium patens*）DNMT3b（PpDNMT3）。PpDNMT3在瞬时和稳定转染的细胞中均能诱导全基因组水平的、依赖于完整催化结构域的稳健非CG甲基化。PpDNMT3的表达与基因表达的改变相关，这种改变与甲基化变化相吻合。启动子和基因体内同时发生CG与非CG高甲基化的基因表现出最强转录抑制。上述结果表明，植物DNMT3酶能够重编程人类表观基因组，为在缺乏内源性非CG甲基化的细胞类型中调控DNA甲基化提供了一种多功能工具。
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**论文主体内容解读**
**一、研究背景与科学问题**
DNA胞嘧啶甲基化是真核生物中一种重要的表观遗传标记，参与调控转录和发育过程。在动物细胞中，绝大多数DNA甲基化发生在CpG二核苷酸上，称为CG甲基化（mCG）。此外，胞嘧啶甲基化也能以较低效率发生在非对称的非CG位点，即非CG甲基化（CH，其中H=A、T或C）。在脊椎动物中，大部分细胞类型缺乏非CG甲基化，但在胚胎干细胞（ESCs）和神经元中该修饰水平显著升高。尽管哺乳动物基因组中非CG位点的丰度约为CG位点的20倍，但其平均甲基化水平通常不足5%。已有研究表明，非CG甲基化参与基因表达调控，例如在神经元中，非CG甲基化可被甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）识别，从而调控神经发育相关基因的表达，其异常与Rett综合征等神经发育障碍有关。在植物中，非CG甲基化更为普遍且功能重要，主要由三类甲基转移酶催化，其中植物DNMT3直系同源物（如小立碗藓的PpDNMT3）以线性催化结构域、不依赖RNA介导的DNA甲基化（RdDM）途径的方式发挥作用。本研究旨在探究植物来源的PpDNMT3是否能在缺乏非CG甲基化的人类细胞（HEK293）中诱导该修饰，并进一步研究其对基因表达的影响。此类工具的开发，将有助于在多种细胞类型中研究非CG甲基化的功能，并为表观基因组编辑提供新策略。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员将经密码子优化的PpDNMT3b基因融合绿色荧光蛋白（GFP）标签，构建到pCDNA3.1+N-eGFP载体中，并在人胚胎肾细胞（HEK293T和HEK293）中实现了瞬时和稳定表达。同时构建了在催化ENV基序发生E205A点突变的Ppdnmt3突变体作为阴性对照。主要采用了以下关键技术：**靶向亚硫酸氢盐测序**（SureSelectXT Methyl-Seq，Agilent）用于全基因组甲基化图谱分析，以区分CG、CHG和CHH序列环境；**DMR鉴定**采用HOME和DMRcaller两种独立软件；**RNA测序**（RNA-seq）用于转录组分析，并通过DESeq2软件包鉴定差异表达基因（DEGs）；结合公共ChIP-seq数据（如H3K9me3、H3K27me3等组蛋白修饰标记）分析甲基化与染色质状态的关系。甲基化测序数据已提交至GEO（GSE302209），RNA-seq数据提交至GEO（GSE302207）。
**三、主要研究结果**
**1. PpDNMT3在人类细胞中诱导非CG甲基化（结果标题1）**
通过靶向亚硫酸氢盐测序发现，表达PpDNMT3的细胞与对照细胞相比，其基因组平均CG和CHG甲基化水平无显著变化，但CHH环境的甲基化水平显著升高。瞬时表达和稳定表达的细胞中，CHH甲基化分别增加了3.4倍（至1.7%）和达到2.2%，其水平与人类神经元和ESC中的非CG甲基化程度相当。催化失活的Ppdnmt3突变体则完全丧失了诱导CHH甲基化的能力，证实该活性依赖于完整的催化结构域。在CHH亚环境中，PpDNMT3对CAC位点显示出最高的甲基化偏好（平均甲基化水平4.7%），这与神经元中的主要非CG甲基化环境一致。DMR分析发现，PpDNMT3表达细胞中CHH高甲基化区域（hyper-DMRs）数量显著多于低甲基化区域（hypo-DMRs），且其基因组覆盖范围超过8.5 Mb，约占靶向测序基因组的10%，表明PpDNMT3能在人类细胞中稳健地建立非CG甲基化。
**2. PpDNMT3影响人类细胞的CG甲基化（结果标题2）**
除非CG甲基化外，PpDNMT3表达还导致CG甲基化水平的双向改变。研究发现，PpDNMT3细胞中CG高甲基化DMRs数量增加，且其长度和甲基化程度均高于对照。同时，稳定表达PpDNMT3和Ppdnmt3的细胞均表现出大量的CG低甲基化DMRs，且两者存在显著重叠，提示该效应可能源于PpDNMT3蛋白（无论其催化活性如何）对内源性CG维持甲基化机制（如DNMT1）的间接干扰。CG高甲基化DMRs与CHH高甲基化DMRs的重叠程度较低，表明两者可能由不同的机制介导。这些结果说明PpDNMT3能以独立于非CG甲基化活性的方式双向影响CG甲基化。
**3. PpDNMT3在异染色质和基因区域诱导非CG甲基化（结果标题3）**
在PpDNMT3的天然宿主小立碗藓基因组中，它主要甲基化转座子。与之一致，在HEK293细胞中，PpDNMT3诱导的CHH甲基化在转座子区域（3.2%）略高于基因区域（2%），但基因区域仍获得显著的非CG甲基化。进一步分析表明，这种对转座子的偏好并非因为高甲基化的CHH亚环境（如CAC）在转座子中富集，而是因为PpDNMT3对转座子中的各CHH亚环境均表现出更高的甲基化效率。PpDNMT3的CHH甲基化富集在沉默染色质标记（如H3K27me3和H3K9me3）修饰的区域，且在转录起始位点（TSS）附近显著降低。此外，PpDNMT3诱导的CHH甲基化水平与内源性CG甲基化水平呈正相关，但在缺乏CG位点的区域也观察到明显的非CG甲基化。这表明PpDNMT3既能靶向与CG甲基化相关的区域，也能独立地在CG缺失区域建立甲基化。
**4. PpDNMT3改变基因表达（结果标题4）**
转录组分析显示，PpDNMT3表达导致1935个基因差异表达，远多于催化失活的Ppdnmt3细胞（829个），且两者DEGs的重叠度显著高于随机预期，提示存在共享的转录效应。在PpDNMT3细胞中，下调基因（down-DEGs）富集于神经发育相关基因本体论。此外，PpDNMT3诱导的下调基因中包含大量长链非编码RNA（lncRNAs），表明其转录调控作用是广泛的。
**5. PpDNMT3的CG与非CG甲基化对基因表达的组合效应（结果标题5）**
通过将DMRs与DEGs相关联，研究发现CG和CHH高甲基化均与基因抑制显著相关（Pearson r = 0.31和0.39），且启动子和基因体中的高甲基化DMRs在下调基因中显著富集。启动子与基因体同时存在高甲基化DMRs的基因，其转录抑制程度显著强于仅启动子或仅基因体存在DMR的基因。约20%的下调基因同时具有CG和CHH高甲基化DMRs，这类基因显示出最强的转录抑制。研究结论指出，CG和非CG甲基化在启动子和基因体中的组合效应共同决定了基因的转录抑制程度。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，PpDNMT3在人类细胞中的非CG甲基化活性既保留了其在植物中的部分特性（如CHH特异性、对异染色质的偏好），也呈现出与人类环境相关的独特性（如对CAC位点的偏好、对基因区域的甲基化）。其甲基化水平与人类神经元和ESC相当，提示其可用于模拟生理相关的非CG甲基化状态。研究还发现，PpDNMT3-induced的非CG甲基化对基因表达的抑制效应与神经元中MeCP2介导的转录抑制机制相呼应，HEK293细胞中表达MeCP2的可能性支持了这一关联。但研究也指出，下调基因富集神经发育功能这一现象在功能丧失突变体中也存在，其生物学意义尚不明确。研究人员提出，PpDNMT3可作为一种可编程的表观遗传信号，通过与失活Cas9（dCas9）融合，有望实现对特定基因组位点的靶向非CG甲基化编辑，为功能研究和潜在治疗应用开辟新途径。
**结论**：本研究证实了植物来源的PpDNMT3能够在通常缺乏非CG甲基化的人类细胞中诱导稳健的非CG甲基化，并伴随温和的CG甲基化效应，且这种甲基化改变能够有效调节基因表达。该发现为利用植物DNMT3酶在多种人类及其他动物细胞类型中建立非CG甲基化提供了可能，也为深入解析非CG甲基化在基因组调控中的作用以及开发新型表观基因组编辑工具奠定了重要基础。
