《Current Research in Food Science》：Long-term fungicide exposure promotes bacterial adaptation and increases virulence of foodborne pathogen
Bacillus cereus in
Caenorhabditis elegans
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农业土壤中农药的广泛污染可能促进人类病原体产生抗菌药物耐药性和表型适应性。然而，作为最常见且临床意义重大的食源性病原体之一，蜡样芽孢杆菌（*Bacillus cereus*）在长期暴露于杀真菌剂后是否表现出此类改变，尚不清楚。本研究考察了八种杀真菌剂——百菌清
农业土壤中农药的广泛污染可能促进人类病原体产生抗菌药物耐药性和表型适应性。然而，作为最常见且临床意义重大的食源性病原体之一，蜡样芽孢杆菌（*Bacillus cereus*）在长期暴露于杀真菌剂后是否表现出此类改变，尚不清楚。本研究考察了八种杀真菌剂——百菌清（chlorothalonil，CHT）、丙森锌（propineb，PRO）、戊唑醇（tebuconazole，TEB）、嘧菌酯（azoxystrobin，AZX）、丙环唑（propiconazole，PCZ）、代森锰锌（mancozeb，MCZ）、多菌灵（carbendazim，CBZ）和三唑酮（triadimefon，TDM）——对蜡样芽孢杆菌的长期影响，重点关注生物膜形成、抗生素敏感性和致病性的变化。结果表明，高浓度下百菌清、丙森锌和戊唑醇完全抑制细菌生长；而暴露于百菌清8 μM、戊唑醇500 μM和丙森锌175 μM 30天可促进细菌适应性，但未引起突变。适应菌株表现出增强的生物膜形成、对庆大霉素和四环素敏感性降低，以及对秀丽隐杆线虫（*Caenorhabditis elegans*）杀伤力增强。进一步的qRT-PCR分析显示，戊唑醇暴露上调了与生物膜发育（*purC*、*purL* 和 *calY*）、多药外排泵（*smr*）相关的抗生素敏感性基因，以及毒力因子（*nheC*、*hblA*、*hblC* 和 *hblD*）相关基因的表达。这些分子变化可能与观察到的蜡样芽孢杆菌生物膜形成增加、抗生素敏感性降低及致病性增强有关。总体而言，这些发现表明长期暴露于杀真菌剂可促进食源性病原体的适应性。该研究为杀真菌剂与病原体相互作用中与细菌应激适应相关的机制提供了深入见解。
**长期杀真菌剂暴露增强蜡样芽孢杆菌适应性、抗生素耐受与毒力的机制研究**
**研究背景与科学问题**
全球超过60%的农业用地面临农药污染风险。农药在保障粮食供应与安全方面不可或缺，但同时会对非靶标生物造成广泛的生态毒理学危害。已有证据表明，农药可能通过诱导突变、激发适应性应激反应或促进抗性基因水平转移等方式，推动微生物群落中抗生素耐药性的发展。例如，嘧菌酯和多菌灵可富集线虫肠道内的细菌耐药组，戊唑醇可促进多药耐药质粒的传播，百菌清则能增强土壤微生物组的代谢适应性。然而，面对环境中种类繁多的杀真菌剂，其是否普遍诱导食源性病原体产生类似效应，尤其在长期暴露下是否导致表型耐药和毒力增强，仍缺乏系统研究。
蜡样芽孢杆菌（*Bacillus cereus*）是一种革兰氏阳性、可形成芽孢的食源性病原体，常见于乳制品、蔬菜、豆类和谷物中（检出率36–45%）。该菌能够产生多种毒素并形成结构多样的生物膜，可导致食物中毒、眼部感染、炭疽样进行性肺炎、暴发性脓毒症及中枢神经系统感染等严重疾病。值得注意的是，蜡样芽孢杆菌已被用于农药污染环境的生物修复，且医院废水中已出现多药耐药（multidrug-resistant，MDR）菌株，提示其抗菌药物耐药性问题日益严峻。然而，长期接触杀真菌剂是否诱导蜡样芽孢杆菌产生适应性表型变化，以及这些变化是否伴随毒力增强，此前尚不清楚。秀丽隐杆线虫（*Caenorhabditis elegans*）作为遗传学上易于操作的无脊椎动物感染模型，其肠上皮为评估病原菌定殖和杀伤提供了可靠读值，适用于评估适应菌株的体内毒力。
**研究目的与研究内容**
本研究旨在探讨八种常用杀真菌剂对蜡样芽孢杆菌生长的影响，评估长期暴露是否改变其适应性、抗生素耐药性和致病性，并阐明潜在的分子机制。研究人员选用百菌清（chlorothalonil，CHT）、丙森锌（propineb，PRO）、戊唑醇（tebuconazole，TEB）、嘧菌酯（azoxystrobin，AZX）、丙环唑（propiconazole，PCZ）、代森锰锌（mancozeb，MCZ）、多菌灵（carbendazim，CBZ）和三唑酮（triadimefon，TDM）进行24小时生长抑制试验；随后选取完全抑制生长的浓度，对蜡样芽孢杆菌进行为期30天的重复“短期暴露—恢复”适应性驯化。通过生物膜形成测定、抗生素敏感性试验、线虫感染模型、肠道定殖试验、qRT-PCR基因表达分析以及全基因组测序，系统评估长期杀真菌剂暴露对蜡样芽孢杆菌表型、毒力和基因组稳定性的影响。
**主要方法与技术**
研究人员采用以下关键技术开展研究：（1）生长抑制试验，测定八种杀真菌剂对蜡样芽孢杆菌（BCRC15850，ATCC33019）的半数抑制浓度及完全抑制浓度；（2）30天长期适应实验，每日以3小时杀真菌剂暴露后恢复培养的方式反复驯化；（3）结晶紫染色法测定生物膜形成能力；（4）微量肉汤稀释法评估庆大霉素和四环素敏感性；（5）以秀丽隐杆线虫N2野生型为感染宿主，进行存活率测定与肠道定殖CFU计数；（6）qRT-PCR检测毒力、生物膜及外排泵相关基因表达；（7）全基因组测序（Illumina NovaSeq X Plus）结合PhaME和FreeBayes流程进行单核苷酸多态性（SNP）鉴定与系统发育分析。统计分析采用Kruskal-Wallis检验、Dunn事后检验、Jonckheere-Terpstra趋势检验、Scheirer-Ray-Hare检验及Mantel-Cox对数秩检验。
**研究结果**
**3.1 杀真菌剂暴露对蜡样芽孢杆菌生长的影响**
24小时生长抑制试验表明，CHT和PRO呈剂量依赖性抑制细菌生长，分别在8 μM和175 μM时完全抑制（p < 0.001）。TEB在50–250 μM无明显抑制，500 μM时显著抑制（p = 0.013）。AZX仅在高浓度（1000–1200 μM）下轻微抑制生长；PCZ在250–290 μM反而显著促进生长，呈现双向刺激效应；MCZ、CBZ和TDM的抑制作用微弱或无作用。研究人员指出，PCZ的促生长现象符合毒物兴奋效应（hormesis），可能与其对细菌靶点抑制力弱且伴随低水平代谢刺激有关。
**3.2 长期杀真菌剂暴露对蜡样芽孢杆菌适应性的影响**
基于上述结果，研究选取CHT 8 μM、TEB 500 μM和PRO 175 μM进行30天重复暴露。在暴露期间，细菌生长在每日3小时暴露中持续受抑制，但存活率逐渐恢复：CHT组从第2天起稳定在85–100%，TEB组第8天后恢复至80–100%，PRO组第12天后升至70–100%。全基因组测序和SNP分析显示，适应菌株与原始菌株序列高度相似，未检测到有意义的基因突变，表明长期暴露诱导的是非突变性表型适应，而非遗传性耐药突变。
**3.3 长期杀真菌剂暴露对生物膜形成的影响**
第5天时，三种杀真菌剂处理组的生物膜形成均显著低于对照组（p < 0.001）。随着适应时间延长，TEB处理组在第10、20和30天均显著增加（p < 0.001），呈上升趋势；PRO组第10天显著增加，但第20天显著低于对照，第30天无显著差异；CHT组从第10天后与对照无显著差异。Scheirer-Ray-Hare分析表明杀真菌剂种类、处理天数及两者交互作用均显著影响生物膜形成（p < 0.001）。这些结果表明长期暴露总体增强了蜡样芽孢杆菌的生物膜形成能力。
**3.4 长期杀真菌剂暴露对抗生素敏感性的影响**
30天适应后，维持亚致死抗生素胁迫时，CHT适应株在庆大霉素4、6、8 μg/mL下生长显著高于对照组；TEB适应株在6和8 μg/mL下显著升高；PRO适应株在8 μg/mL下显著升高。四环素试验中，仅CHT和TEB适应株在8 μg/mL下略有改善。但所有组在≥16 μg/mL的抗生素浓度下均无生长，按CLSI标准尚不构成经典耐药，提示这是生理性耐受（tolerance）而非遗传性耐药。统计检验确认杀真菌剂处理对抗生素胁迫下存活具有显著效应（p = 0.002和0.005）。
**3.5 长期杀真菌剂暴露对蜡样芽孢杆菌致病性的影响**
在线虫感染模型中，30天适应后的CHT、TEB和PRO处理组均显著提高线虫死亡率（p < 0.001），其中TEB组的致死速度最快，3天内大部分线虫死亡。肠道定殖试验显示，TEB适应株在线虫肠道内的定殖水平显著高于对照组（p = 0.025），表明长期暴露增强细菌在宿主内的持久性。
**3.6 长期杀真菌剂暴露对基因表达的影响**
qRT-PCR分析发现，TEB适应株中除*nheA*、*nheB*、*codY*和*mate*外，其余测试基因均显著上调。其中与生物膜形成相关的嘌呤合成基因*purC*、*purL*（p = 0.042）和双功能蛋白基因*calY*（p = 0.005）表达升高；多药外排泵基因*smr*显著上调，与抗生素敏感性降低相符；编码非溶血性肠毒素（NHE）和溶血素BL（HBL）的毒力基因*nheC*、*hblA*、*hblC*、*hblD*均显著上调（p = 0.042）。此外，TEB适应株在庆大霉素（6 μg/mL）存在下仍持续高表达上述基因，提示其可能使抗生素治疗复杂化。
**讨论与结论**
研究讨论指出，长期杀真菌剂暴露诱导的表型变化并未伴随可检测的基因组突变，符合非突变性应激适应（如耐受性）的特征，与先前关于细菌在消毒剂或抗生素循环下通过延长滞后期或形成持久菌来提升耐受性的观察一致。环境相关浓度方面，CHT 8 μM（约2.13 mg/L）接近某些食品中的残留水平，而TEB 500 μM（约154 mg/L）和PRO 175 μM（约51 mg/L）高于食品残留浓度，因此结果应视为控制条件下的危害识别而非直接的环境风险证据。研究局限性包括仅使用单株参考菌株、实验浓度与真实暴露场景不完全一致、基因表达分析仅限于TEB适应株。
结论部分指出，实验室条件下长期反复暴露于CHT、TEB或PRO可诱导蜡样芽孢杆菌BCRC15850产生持续的表型改变，包括生物膜形成模式改变、对庆大霉素和四环素敏感性降低，以及对感染宿主秀丽隐杆线虫致死性增强。这些变化在缺乏可检测的基因组突变下发生，表明是由非突变性应激适应而非抗生素耐药性所致。在TEB适应谱系中，生物膜形成（*purC*、*purL*、*calY*）、外排机制（*smr*）和毒力（*nheC*、*hblA*、*hblC*、*hblD*）相关基因的表达改变与观察到的表型变化一致，但转录相关性不能确立因果性，也不应外推至CHT或PRO适应谱系。未来研究应纳入多种蜡样芽孢杆菌分离株、环境相关浓度和真实暴露情景、标准化MIC测定、表型可逆性评估及跨杀真菌剂处理的比较分子分析，以确定其实际意义。
