《PLOS Computational Biology》：Direct microhaplotype genotyping for GT-seq (Genotyping-in-Thousands by Sequencing) using a diploid abundance model
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GT-seq（Genotyping-in-Thousands by Sequencing）被广泛用于高通量扩增子基因分型，但大多数分析流程聚焦于单个SNP或依赖基于比对的变异检出。研究人员提出了一种直接微单倍型（microhaplotype）基因分型框架，利用
GT-seq（Genotyping-in-Thousands by Sequencing）被广泛用于高通量扩增子基因分型，但大多数分析流程聚焦于单个SNP或依赖基于比对的变异检出。研究人员提出了一种直接微单倍型（microhaplotype）基因分型框架，利用双端Illumina和Element测序典型的高读序深度和低错误率。该流程首先识别引物界定读段（primer-bounded reads），并将双端序列解析为质量感知的一致性扩增子序列。在每个样本和位点内，唯一序列按读段丰度排序，保留丰度最高的一或两条序列作为直接观测到的单倍型。这些等位基因跨样本汇总，构建每个位点的观测单倍型目录。在第二轮分析中，读段通过精确序列匹配分配到目录单倍型，从而产生二倍体基因型。最后，比较目录单倍型序列以识别相型SNP和压缩的插入缺失变异。可选地，目录单倍型可与参考基因组比对，将观测变异投射到基因组坐标并生成符合标准的VCF输出。该框架能够直接从高深度扩增子测序数据进行稳健的微单倍型基因分型。与独立的BWA/BCFtools基于比对的工作流程比较，在96个个体中跨越1,085个SNP的102,520次基因型比较中显示出99.67%的基因型一致性。即使在每位点10条读段的最低支持测序深度下，基因型一致性仍保持在99.4%以上，表明该方法在较宽的测序深度范围内具有稳健性能。
研究背景、问题与研究意义：靶向扩增子测序已成为生态学、保护生物学、渔业、水产养殖和育种研究中的重要高通量基因分型方法，GT-seq（Genotyping-in-Thousands by Sequencing）是其中应用广泛的高性价比方案。现有GT-seq分析流程通常只对预先定义的SNP（单核苷酸多态性）或单倍型靶标进行基因分型，或依赖读段比对和变异检出，而非直接从测序读段重建完整扩增子单倍型。由于GT-seq扩增子通常覆盖完整目标区，多个多态位点可在同一条测序读段上被同时观测，形成比单SNP信息量更高的微单倍型（microhaplotype）。研究人员因此开发了直接微单倍型基因分型框架，将传统分析顺序倒置：先重建单倍型，再提取多态位点，以提高现有GT-seq数据的标记信息量，并可在不改变实验流程的情况下重新分析已有数据。
主要技术方法包括：（1）引物界定读段解析：通过已知正反向引物序列鉴定目的扩增子，仅保留含正确引物组合的读段对，利用碱基质量将双端读段重建为完整的一致扩增子序列；（2）等位基因发现与目录构建：在每个样本和位点内统计唯一序列的读段丰度，按丰度保留前1或2条序列作为候选等位基因，跨样本汇总构建位点特异性单倍型目录；（3）二倍体丰度模型基因型推断：第二轮分析中采用精确序列匹配将读段分配到目录单倍型，根据第二高丰度等位基因比例（A2）区分纯合与杂合基因型；（4）微单倍型提取与VCF输出：比较目录单倍型序列识别相型SNP和压缩的插入缺失变异（indel），并可选择将目录单倍型比对到参考基因组，生成符合标准的VCF（变异调用格式，Variant Call Format）输出。样本数据来自96个胡瓜鱼（Hypomesus transpacificus）个体的410位点GT-seq panel，同一文库分别采用Element AVITI和Illumina NovaSeq X平台进行双端测序。
研究结果：
1. 引物界定读段重建高效回收GT-seq扩增子。该研究对96个样本的全数据集进行分析，共获得234,935,633条原始读段对，其中164,209,863条（69.9%）被保留为引物界定读段，平均每个样本1,710,519条，证明基于引物锚定的读段解析能够从复杂多重扩增子文库中高效回收目标序列。
2. 从重建扩增子直接推断微单倍型。以位点NC_061065.1_5347094为例，该位点包含SNP和短indel多态性；通过丰度排序和目录构建，研究人员直接从读段中恢复了相型单倍型，并通过第二轮精确匹配进行基因分型，无需参考比对或常规变异检出。
3. 基于丰度的二倍体基因分型。基因型调用依据第二高丰度等位基因比例（A2）：杂合个体通常两个单倍型比例接近0.5，纯合个体A2极低；该模型利用高深度扩增子测序数据实现简单稳健的基因型推断，并通过位点级质量仪表盘汇总等位基因频率和基因型组成。
4. 提取相型微单倍型。对目录单倍型进行位置比较可识别SNP和短indel，且由于每个单倍型来自连续DNA片段，多态位点的连锁相被直接保留；二倍体基因型表示为成对单倍型序列，从而形成多等位基因微单倍型。
5. 跨平台可重复性。同一GT-seq文库分别经Element和Illumina NovaSeq X测序后，410个位点和96个个体的基因型一致性为99.96%；样本水平一致性均超过99.5%，大多数样本超过99.9%，未发现样本错配或系统性平台偏差。
6. 与独立比对流程的一致性。将相同引物界定读段分别输入BWA/BCFtools比对变异检出流程和直接微单倍型管道（--emit-vcf输出），共比较1,085个共享SNP、102,520个非缺失基因型，总体一致性为99.67%；直接管道保守地扣留了1,636个比对流程赋予的基因型，未产生比对流程未支持的基因型；不一致主要集中于少数位点的纯合/杂合分类差异。
7. 不同测序深度下的稳健性。按位点随机抽稀至最大深度10、25、50、100和200条读段后，10条/位点时成功检出位点的一致性仍为99.46%，但仅有13.8%的全深度基因型被恢复；25条/位点时恢复率升至97.2%、一致性99.67%；50条/位点及以上恢复率超过98.8%，一致性超过99.8%。
8. 微单倍型提高标记信息量。在410个匹配位点中，微单倍型平均每个位点4.19个等位基因，而单SNP为2.00个；平均多态信息含量（polymorphism information content, PIC）从单SNP的0.358提高到微单倍型的0.510，中位数从0.366提高到0.528，平均PIC增加约42%。
讨论部分指出，直接微单倍型推断依赖于二倍体丰度模型，其假设每个位点是二倍体基因组中的单拷贝目标；若同一引物对扩增多个基因组区域或发生非特异性扩增，样本中会出现多于两个高丰度序列，算法会故意不产生基因型调用，这可作为问题位点的诊断指标。该模型适用于二倍体物种，但可扩展至四倍体等复杂基因型模型。三项独立验证（跨平台、与BWA/BCFtools比较、深度抽稀）表明该方法准确、可重复且稳健。研究结论可翻译为：通过将完整单倍型作为主要分析信号，并在重建单倍型后再识别个体多态性，直接微单倍型框架为高深度扩增子测序数据提供了一种高效、准确且可重复的基因分型策略，同时保留比传统单SNP分析更多的遗传信息；由于该方法完全在软件中运行，许多现有GT-seq数据集和已发表panel可立即重新分析为多等位基因微单倍型，而无需产生新的实验室数据。
