**ENNs和BEA体外内分泌干扰效应：基于OECD指南的雌激素/雄激素受体转录活性及类固醇合成酶基因表达评估**

《Emerging Contaminants》：In vitro endocrine-disrupting effects of Enniatins and Beauvericin: assessment of estrogen and androgen receptor transcriptional activities and gene expression of enzymes of the steroid synthesis pathway

　　

霉菌毒素恩镰孢菌素（Enniatins，ENNs）和白僵菌素（Beauvericin，BEA）因气候变化促进真菌产生而在谷物中日益增多，成为备受关注的新兴污染物。其潜在的内分泌干扰活性引发一定担忧，因此需对相关内分泌模态进行全面评估。在欧洲化学品风险评估合作伙伴关系（PARC）框架下，研究人员根据经济合作与发展组织（OECD）测试指南（TG）第455号和458号，利用hERα-HeLa9903和AR-EcoScreen细胞系评估了ENN A、A1、B、B1和BEA（1 nM – 1 μM）对雌激素受体α（ERα）和雄激素受体（AR）的转录激活活性。基于此前关于类固醇合成的研究发现，研究人员还依据OECD TG第456号评估了H295R细胞系中类固醇合成酶基因的表达。结果表明，在非细胞毒性浓度下，这些霉菌毒素对ERα和AR不发挥任何激动或拮抗转录激活活性。相反，ENN A、A1和BEA显著抑制了调控胆固醇转化的类固醇合成基因的表达。此外，除ENN B外的所有毒素主要诱导了编码催化孕酮、醛固酮和皮质醇合成酶的基因表达，并在较小程度上诱导了睾酮和雌二醇相关基因表达，但呈现不同模式。总体而言，研究结果证明ENNs和BEA对类固醇合成具有选择性内分泌干扰活性，有助于完善这些新兴污染物的风险评估。

## ENNs和BEA体外内分泌干扰效应研究：基于OECD指南对ERα/AR转录活性及类固醇合成酶基因表达的系统评估

### 一、研究背景与科学问题

恩镰孢菌素（Enniatins，ENNs）和白僵菌素（Beauvericin，BEA）是由镰刀菌属（*Fusarium*）真菌产生的低分子量霉菌毒素，主要存在于受真菌污染的谷物及其制品中。受气候变化和温度升高的影响，这些霉菌毒素在食品中的存在可能进一步增长。ENNs和BEA因其毒理学信息匮乏且缺乏法定最大限量标准，被视为“新兴霉菌毒素”。欧洲食品安全局（EFSA）评估报告指出，在已鉴定的29种ENN类似物中，ENN A、ENN A1、ENN B和ENN B1与BEA是食品和饲料中最常见的种类。

已有毒理学文献揭示，其潜在的生殖和内分泌干扰活性是主要的健康安全关切之一，然而目前体内和体外研究证据尚不充分，难以就威胁作出充分评估。在具体实验证据方面，已有研究显示ENN B在小鼠中可增加雌性子宫内膜面积并降低雄性雌二醇水平，BEA可引起雌性子宫内膜增生和雄性睾丸生殖细胞改变并伴随睾酮水平下降，ENN B1可降低小鼠睾酮水平并造成睾丸组织病理学改变。在细胞模型中，ENN B1在TM3 Leydig细胞中可通过调节Keap1/Nrf2/HO-1和JAK/STAT3信号通路诱导氧化应激，并在MA-10 Leydig细胞中剂量依赖性地降低睾酮和人绒毛膜促性腺激素（hCG）诱导的孕酮水平。此外，在H295R人肾上腺皮质癌细胞中，ENN B（10和100 μM）降低了睾酮、皮质醇和孕酮水平，但最高浓度已表现出细胞毒性。近期一项完全遵循OECD TG第456号的研究在非细胞毒性浓度（最高1 μM）下全面考察了BEA和ENNs对H295R细胞的影响，发现不同霉菌毒素对雌激素、睾酮、孕酮、醛固酮和皮质醇的产生具有各异的影响模式。

关于类固醇激素受体，文献报道存在矛盾：有研究显示ENN A1和B1对ERα和AR均有拮抗效应，BEA可抑制配体诱导的AR二聚化；另有研究报道BEA在AR-EcoScreen细胞系中仅表现出抗雄激素活性而无抗雌激素活性；还有研究表明BEA对孕激素和糖皮质激素受体具有拮抗效应而ENN B无活性。总体来看，现有关于ENNs和BEA对类固醇受体及类固醇合成影响的文献数据零散、匮乏且总体上不确定。

在这背景下，本研究作为欧洲化学品风险评估合作伙伴关系（PARC）项目5.1.1a的一部分，旨在填补优先ENNs（ENN A、A1、B和B1）及BEA在雌激素、雄激素和类固醇合成（EAS）模态方面的内分泌效应数据空白。

### 二、研究内容、结论与意义

研究人员遵循内分泌干扰物识别指南（ECHA和EFSA 2018），采用OECD概念框架第2级体外试验方法，依据OECD TG第455号和458号分别研究了五种霉菌毒素对ERα和AR的转录激活活性，并作为对前期类固醇合成研究的机制性补充，依据OECD TG第456号评估了霉菌毒素诱导的类固醇合成酶基因表达变化。

研究结果表明，在非细胞毒性浓度（最高1 μM）下，ENNs和BEA对人ERα和AR均无激动或拮抗活性。然而，除ENN B外，所有霉菌毒素均改变了类固醇合成酶基因的表达（仅芳香化酶基因CYP19A1除外）。具体而言，ENN A、A1和BEA强烈下调类固醇合成通路上游基因STAR、CYP11A1和CYP17A1的表达，同时上调HSD3B2、CYP11B1、CYP11B2、HSD17B1和HSD17B4等下游基因的表达，尽管模式各异。该研究提供了非细胞毒性浓度下ENNs和BEA内分泌干扰效应的首个OECD一致性证据，证实其选择性干扰类固醇合成而非通过核受体介导，并为未来风险评估和监管排序提供机制性数据支持。

### 三、主要技术方法

研究人员采用三种体外细胞模型及相应OECD标准方法。（1）利用AR-EcoScreen细胞系（源自中国仓鼠卵巢细胞，JCRB1328）按OECD TG第458号进行AR稳转转录激活试验（AR STTA），浓度范围为0.001至6.0 μM，采用双荧光素酶报告系统同时测定AR响应（萤火虫荧光素酶）和细胞毒性（海肾荧光素酶）。（2）利用hERα-HeLa9903细胞系（JCRB1318-HeLa9903）按OECD TG第455号进行ER稳转转录激活试验（ER STTA），以WST-1法评估细胞毒性，激动试验浓度1 nM至1 μM，拮抗试验浓度3 nM至1 μM。（3）利用H295R人肾上腺皮质癌细胞系（ATCC CRL-2128）按OECD TG第456号进行类固醇合成酶基因的定量实时PCR（qPCR）分析，细胞以ENN A（100和500 nM）、ENN A1、B、B1和BEA（均为100 nM和1 μM）处理48 h后提取RNA并逆转录，检测STAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP17A1、HSD17B1、CYP21A2、CYP11B1、CYP11B2、HSD17B4、CYP19A1基因表达，以ACTB为管家基因。

### 四、主要研究结果

**4.1 AR STTA结果**

在AR激动试验中，所有五种霉菌毒素在非细胞毒性浓度下均未达到10%的相对转录活性（RTA）诱导阈值，依据OECD TG第458号标准判定为AR激动活性阴性。在AR拮抗试验中，所有霉菌毒素在非细胞毒性浓度下均无法抑制二氢睾酮（DHT）诱导的RTA，logIC₃₀无法计算，判定为AR拮抗活性阴性。所有ENNs和BEA在3 μM浓度下均观察到AR-EcoScreen细胞活力显著下降。

**4.2 ER STTA结果**

在ER激动试验中，阳性对照双酚A（BPA）表现出显著激活作用（PC₁₀：137 nM，PC₅₀：762 nM），而五种霉菌毒素的发光信号均未达到1 nM雌二醇（E2）信号的10%，判定为阴性。在ER拮抗试验中，阳性对照4-羟他莫昔芬（OHT，1 μM）和Tamoxifen（IC₅₀：0.93 μM）显著抑制ER转录活性，而五种霉菌毒素均未将E2（50 pM）的RTA信号抑制至70%以下，判定为阴性。

**4.3 类固醇合成酶qPCR结果**

ENN B未影响任何基因表达，而ENN A、A1和BEA表现出相似效应：在最高测试浓度（1 μM）下，显著降低上游基因STAR、CYP11A1和CYP17A1的表达（下降幅度从不足2倍到超过22倍不等），同时将HSD3B2表达上调近5倍（BEA在两个测试浓度均上调）。CYP21A2的表达被ENN A显著上调、被ENN B1在1 μM时抑制，幅度均约2倍。CYP11B1和CYP11B2在最高浓度下被ENN A、A1、B1诱导，在BEA两个浓度下均被诱导，其中ENN A1和BEA上调超过9倍。HSD17B1和HSD17B4呈现类似模式，ENN A1上调HSD17B1超过8倍。编码芳香化酶的CYP19A1不受任何霉菌毒素显著影响。

### 五、讨论总结与研究结论

研究结果首次在OECD标准化条件下全面揭示了五种膳食相关新兴霉菌毒素的内分泌干扰特性。讨论部分指出，ENNs和BEA在低于细胞毒性剂量下不通过ERα和AR介导效应，这一结论得到一项针对23种核受体的计算机模拟筛选研究的支持，五种霉菌毒素对ER、AR等核受体均未显示结合亲和力。因此，这些化合物的内分泌干扰特性不太可能主要通过直接干扰激素受体介导。

关于基因表达结果，ENN A、A1和BEA对上游基因（STAR、CYP11A1和CYP17A1）的强效下调与此前发现这些霉菌毒素可抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）活性的研究一致，效力排序为BEA > ENN A > ENN A1 > ENN B1 > ENN B。ACAT、STAR和CYP11A1的表达均受类固醇生成因子-1（SF-1）调控，ENN B和B1抑制ACAT效能较低可能解释了其未显著调节上游基因表达的原因。近期研究也证实所有ENNs和BEA（ENN B除外）均降低HepaRG肝细胞球体中总胆固醇含量，进一步支持ENN B对胆固醇稳态影响较小。下游基因的上调（如HSD3B2、CYP11B2）与此前观察到的孕酮和醛固酮水平增加一致，但皮质醇变化的机制较为复杂，可能涉及其他尚待阐明的途径。

研究人员还将自身结果与文献进行了系统比较，指出既往研究中观察到的基因表达调控或受体拮抗效应多发生在细胞毒性浓度或接近细胞毒性的浓度下，而本研究在严格遵循OECD指南的非细胞毒性浓度下提供了证据。此外，ENN B活性普遍较低可能归因于其化学结构最简单、取代基空间位阻最小。

在人体暴露方面，截至2026年6月的人体生物监测数据显示，血液中ENN B（0.18 μg/L）和BEA（1.12 μg/L）最高检出值对应的循环浓度（0.28 nM和1.43 nM）比显著影响类固醇激素合成和基因表达的有效浓度低一个数量级，但这可能因未考虑毒代动力学（如暴露后血浆峰值水平、I相代谢）、加和/协同混合物效应以及慢性暴露的组织蓄积而低估危害。

研究结论为：新兴霉菌毒素ENN A、A1、B、B1和BEA在非细胞毒性浓度下不改变ERα和AR的激活；研究人员在机制层面进一步支持了这些化合物对类固醇合成的干扰，证明其抑制胆固醇转化并诱导下游事件（尤其是控制孕酮和皮质类固醇合成的事件），其中仅BEA在两个测试浓度均显著改变了部分类固醇合成酶的表达。这些发现为未来监管考量提供支持，因为ENNs和BEA仍属无特定最大限量或健康指导值的新兴霉菌毒素。通过提供非细胞毒性浓度下的机制性体外证据，本研究为未来风险评估和监管优先排序做出了贡献，尤其考虑到其在谷物类商品中的普遍存在、气候变化对污染模式的潜在影响以及多种新兴霉菌毒素共同暴露的累积效应。