《Food and Bioproducts Processing》：Response Surface Optimization of Cost-Effective Enzymatic Hydrolysis of Slaughterhouse Blood Using Kiwi Waste for Antioxidant Peptide Production
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成本是处理屠宰场血液等富含蛋白质废弃物的主要障碍，因为传统水解依赖纯化的商业蛋白酶（commercial proteases），在经济上不适合规模化应用。本研究旨在首次开发并优化一种低成本的"以废治废"酶解策略，利用猕猴桃废弃物（kiwi waste，KW
成本是处理屠宰场血液等富含蛋白质废弃物的主要障碍，因为传统水解依赖纯化的商业蛋白酶（commercial proteases），在经济上不适合规模化应用。本研究旨在首次开发并优化一种低成本的"以废治废"酶解策略，利用猕猴桃废弃物（kiwi waste，KW）作为直接的、未经提取的蛋白酶来源，在环境温度（21 °C）、无化学试剂、不控制pH的条件下对牛血（cow blood，CB）进行水解。采用中心复合设计（central composite design，CCD）评估水解时间以及KW和CB浓度对蛋白质减少（protein reduction，Pred）、游离氨基酸浓度（free amino acids concentration，FAA）和挥发性固体减少（volatile solids reduction，VSred）的影响。所有响应模型均显著（p < 0.0001），R2 > 0.95。在响应面法（response surface methodology，RSM）设计空间内，Pred接近90%，FAA浓度达到约2300 μg mL?1，VSred达到约40%。数值优化确定了选定条件（168 h、12 g VS L?1 KW、6 g VS L?1 CB），预测Pred为57.83%，FAA为2193.72 μg mL?1，总体期望值为0.928。抗氧化活性显著增强，DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼基）清除率从7.4%上升至71.9%，总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）从12.36 μM TE上升至33.44 μM TE。总氨氮（total ammonia nitrogen，TAN）的增加反映了水解过程中氮的释放，而傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析支持肽键断裂和与蛋白质水解一致的结构变化。与需要提取、加热或化学投入的酶基预处理相比，该方法提供了一种简化的、可扩展的替代方案，降低了工艺成本和能源需求。所提出的"以废治废"策略能够同时实现KW和CB的价值化，产生富含抗氧化剂的水解产物，在食品、营养保健品、制药和基于厌氧消化的生物能源系统中具有潜在应用。
**论文解读**
**一、研究背景与现存问题**
屠宰场废弃物（slaughterhouse waste，SHW）的可持续管理面临巨大的经济障碍。据统计，屠宰动物约45%的质量（包括血液、骨骼、羽毛等）成为必须处理或回收的废弃物。其中，新鲜血液因其极高的化学需氧量（chemical oxygen demand，COD，375–400 g L
?1）和生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD，140–200 g L
?1）而构成极端污染负荷；然而，目前仅有约30%的屠宰场血液得到利用，其余则排入下水道或填埋，造成环境污染。血液是一种富含蛋白质的宝贵基质（蛋白质含量约18%，血红蛋白占可溶性蛋白的50%以上），既是生物活性化合物回收的优良原料，也是厌氧消化（anaerobic digestion，AD）产沼气的潜在底物，但其有效利用依赖于蛋白质水解这一预处理步骤。
传统上，蛋白质水解依赖纯化的商业蛋白酶，然而商业酶的生产成本极高——以菠萝蛋白酶（bromelain）为例，提取和纯化占生产总成本的70%–90%，市场价高达2400 USD kg
?1；纯化酶的成本可达粗提物的150倍。此外，工业水解还需要耗能的搅拌、加热和pH控制。这些因素使得基于纯化酶的血液水解预处理在经济上不切实际。因此，亟需开发一种低成本、低能耗的水解策略，以实现屠宰场血液蛋白的有效回收。
猕猴桃废弃物（kiwi waste，KW）含有猕猴桃蛋白酶（actinidin，EC 3.4.22.14），这是一种属于木瓜蛋白酶家族的主要半胱氨酸蛋白酶，占猕猴桃总可溶性蛋白的50%–60%，能在温和pH和环境温度下裂解肽键。尽管已有大量关于纯化猕猴桃蛋白酶的研究，但其直接以未经提取的KW形式在废弃物处理条件下水解牛血（cow blood，CB）的性能此前从未被量化。基于此，研究人员开展了本研究，旨在评估和优化利用未提取KW作为低成本蛋白酶来源、在环境温度和无试剂条件下水解CB的可行性，并验证水解产物是否具有抗氧化活性。
**二、主要关键技术方法**
研究人员采用中心复合设计（CCD）结合响应面法（RSM）进行实验优化。CB采集自加拿大纽芬兰与拉布拉多省圣约翰市的当地屠宰场，KW由过熟猕猴桃去皮后的果皮和种子经研磨制备。以水解时间（X
1，24–168 h）、KW浓度（X
2，4–12 g VS L
?1）和CB浓度（X
3，3–6 g VS L
?1）为自变量，以蛋白质减少（Pred）、游离氨基酸浓度（FAA）和挥发性固体减少（VS
red）为响应变量，建立二阶回归模型。分析方法包括：Bradford法测定蛋白质浓度，茚三酮比色法测定FAA，Nessler法测定总氨氮（TAN），DPPH自由基清除法和MAK334试剂盒测定抗氧化活性，以及傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析水解前后的结构变化。
**三、研究结果**
（一）RSM模型性能与统计分析
三个响应变量的简化回归模型均具有高度显著的F统计量（Pred = 114.62，FAA = 70.52，VS
red = 67.46；p < 0.0001），决定系数R2均大于0.95，表明二次回归模型能很好地描述酶解行为。Pred和VS
red模型的失拟检验不显著，确认模型无系统偏差。在所有线性效应中，水解时间影响最大，其次是CB浓度和KW浓度。
（二）蛋白质减少（Pred）的响应面分析
响应面图显示水解时间与KW浓度之间存在显著的协同效应，Pred在最高水平（168 h、约12 g VS L
?1 KW）时接近90%。这表明未提取KW中的蛋白酶在持续酶–底物接触条件下能够实现与纯化酶相当的水解效率。
（三）游离氨基酸浓度（FAA）的响应面分析
FAA浓度随水解时间和底物浓度的增加而持续上升，在168 h和较高KW负载条件下可达约2300 μg mL
?1。FAA积累主要受反应时间控制，酶负载量调节的是释放速率而非最终程度。
（四）挥发性固体减少（VS
red）的响应面分析
VS
red在最高实验条件下达到约40%，但响应面较为平坦，表明非蛋白质组分（如KW中的纤维素、木质素和果胶）未被猕猴桃蛋白酶（actinidin）降解——因为actinidin是一种半胱氨酸蛋白酶，选择性水解蛋白质底物，而不分解植物多糖。
（五）多响应优化结果
数值优化确定最优条件为168 h、12 g VS L
?1 KW和6 g VS L
?1 CB，预测Pred为57.83%，FAA为2193.72 μg mL
?1，总体期望值达0.928。验证实验中，蛋白质浓度从1908 μg mL
?1降至186 μg mL
?1（实验Pred约90.25%），FAA从85 μg mL
?1增至1820 μg mL
?1，FAA产率在168 h时达约95%。
（六）TAN动态变化
TAN在0–96 h从44.23 mg L
?1升至79.20 mg L
?1，反映活跃的脱氨作用；随后在168 h降至48.45 mg L
?1，与FAA产率趋于平台期一致，表明可脱氨氨基酸减少。
（七）抗氧化活性评估
在活性KW:CB系统中，DPPH清除率从7.4%增至约71.9%，TAC从12.36 μM TE增至33.44 μM TE（分别约为9.7倍和2.7倍增长），而对照组和热灭活处理组变化极小，证实抗氧化活性增强是酶依赖性的，且与蛋白质水解程度密切相关。
（八）FTIR光谱表征
FTIR分析显示，水解168 h后，酰胺A带（3286 cm
?1）变宽减弱，表明氢键改变和蛋白质去折叠；酰胺I带（1633 cm
?1）强度下降，反映肽键断裂和α-螺旋/β-折叠结构丧失；酰胺II带（约1579和1517 cm
?1）减弱移位，证实N-H氢键丧失和肽键裂解；酰胺III带（1235 cm
?1）减弱，表明有序蛋白骨架被破坏。同时，C-O/C-O-C拉伸区（1119–1027 cm
?1）强度增加，二硫键区域（529–515 cm
?1）变化轻微，表明蛋白质发生了广泛的构象改变。
**四、讨论总结与结论翻译**
本研究成功证明了未经提取的KW作为蛋白水解酶来源，在温和、低成本的条件下可有效水解CB蛋白。RSM优化确定了理想参数（168 h、12 g VS L
?1 KW、6 g VS L
?1 CB），预测Pred为57.83%，FAA为2193.72 μg mL
?1，期望值为0.928。验证实验证实了模型的准确性。水解产物显示出高抗氧化活性：DPPH清除率从7.4%增至71.9%，TAC从12.36 μM TE增至33.44 μM TE。FTIR分析指示了与蛋白质水解和肽键断裂一致的结构变化。这些发现凸显了利用未加工水果废弃物作为蛋白酶来源的生物技术和经济潜力，为同时价值化农业工业残余物和屠宰场副产物提供了可持续的解决方案。该策略最大限度地降低了酶生产成本，同时有助于实现环境负责任的废弃物管理。然而，未来仍需进行放大验证和正式的技术经济分析以确认工业可行性。
